青蒿琥酯对大鼠缺血再灌注视网膜损伤保护作用的研究

毕家瑞，刘发兰，刘娟

视网膜作为视觉传导通路中的中间环节，在感受光刺激、传递神经信号方面发挥重要作用。视网膜营养主要由视网膜中央动脉提供，视网膜中央动脉是终末血管，管径细，分支多，极易发生缺血，并可迅速导致视网膜的严重损伤。缺血性视网膜疾病在眼底病中占有很大比例，其常见的原因包括眼动脉血液灌注不足引起的低灌注性视网膜疾病、眼缺血综合征、视网膜中央动脉阻塞、视网膜中央静脉阻塞、高眼压以及影响视网膜血流量的眼科手术等。当视网膜组织缺血或视网膜血流灌注明显下降时，引起视网膜神经细胞功能障碍，部分细胞功能损伤不可逆，严重影响预后视力。部分病例的视网膜血管缺血后在一定时间内又重新获得再通，视网膜组织逐渐恢复血流并再次得到灌注，这个过程称之为视网膜缺血再灌注损伤。视网膜缺血再灌注损伤引起视网膜组织缺氧、缺血，能量代谢障碍引起视功能下降[1]。青蒿琥酯（artesunate）是具有过氧桥结构的倍半萜内酯类化合物，药理作用广泛，能够减轻炎症反应，抑制肿瘤生长，降低细胞氧化应激损伤[2-4]。本实验通过采用前房灌注生理盐水升高眼内压法建立SD大鼠缺血再灌注视网膜组织损伤模型，探讨青蒿琥酯对大鼠缺血再灌注视网膜组织损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

48 只SPF 级雄性SD 大鼠（体质量200～280 g），均符合国家医用动物一级动物使用标准，由哈尔滨医科大学附属第一医院动物实验中心提供［生产合格证：SCXX（黑）2019-001］。

1.2 材料

青蒿琥酯（纯度≥99%，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：H32020967)），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性检测试剂盒、过氧化氢酶（catalase，CAT）活性检测试剂盒、丙二醛（malondialedhyde，MDA）活性检测试剂盒（上海碧云天公司），RIPA 蛋白裂解液、Caspase-3、Caspase-9 抗体（南京建成生物工程研究所）。

1.3 分组及造模

48 只SD 大鼠随机分为对照组（SOG）、模型组（MG）、青蒿琥酯低（ALG）、高浓度治疗组（AHG），每组12 只，除对照组外，其余3 组SD 大鼠水合氯醛麻醉，眼表滴用2%丁卡因麻醉，4.5 号头皮针通过输液管连接到生理盐水瓶输液上，输液瓶与大鼠眼表垂直高度为1.5 m，沿颞侧角膜缘将头皮针刺入前房（避免接触角膜内皮及晶状体），此时观察前房加深，角膜雾状浑浊，瞳孔对光反射消失，视网膜血供中断，持续1 h 后拔除针头，视网膜血供恢复，模型建立成功。青蒿琥酯低、高浓度组于模型制作完成后立刻将青蒿琥酯（10 mg/kg、20 mg/kg）注射于腹腔内，对照组和模型组大鼠腹腔内注射等体积0.9%Nacl 注射液，连续注射7 d，每日1 次。

1.4 大鼠视网膜取材及制备

断头处死各组实验大鼠，摘取眼球后生理盐水冲洗后剥离视网膜组织，每组随机取3 只大鼠视网膜置于10%多聚甲醛溶液中固定，用于HE 染色；取3 只大鼠视网膜组织置于2.5%戊二醛溶液中固定用于透射电镜观察；剩余视网膜组织用于免疫组织化学检测。

1.5 视网膜组织HE 染色

大鼠视网膜组织用二甲苯进行脱蜡处理，制备石蜡切片，梯度酒精脱水，蒸馏水反复冲洗，苏木素染液浸泡10 min 后氨水及酸水分色，置于梯度酒精溶液浸泡10 min，HE 染色30 s，封片后拍照。

1.6 电镜观察视网膜组织

取出戊二醛固定液中的视网膜组织，蒸馏水反复冲洗后四氧化锇（OsO4）固定2 h，梯度酒精脱水，染色后环氧树脂包埋，制备超薄切片，透射电镜观察大鼠视网膜内核层细胞并拍照。

1.7 检测氧化应激指标SOD、CAT 活性及MDA 含量

取视网膜组织匀浆，细胞裂解液裂解后4℃离心（10，000 rpm）10 min，收集上清液在冰浴上操作：取200 μm 上清加入到96 孔板中，用分光光度计在酶标仪上测定吸光度。

1.8 蛋白质印迹法检测Caspase-3 及Caspase-9

研磨视网膜组织，冰上以蛋白裂解液提取蛋白，离心机离心（12000 r/min）后弃上清，将蛋白行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后室温封闭2 h，孵育加入一抗（Caspase-3 及Caspase-9），1 h 后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG，TBST 洗膜3 次后，于暗室扫膜显影。

1.9 统计学方法

采用SPSS 17.0 对实验数据进行分析，计量资料比较采用单因素方差分析（ANOVA），两两比较采用SNK-q 检验，以P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠视网膜组织病理改变

对照组大鼠视网膜各层组织结构清晰，内、外核层细胞排列致密；模型组大鼠视网膜结构变薄，内核层及外核层厚度明显减少，青蒿琥酯治疗组与模型组相比，内层视网膜厚度增加（图1）。

2.2 视网膜组织电镜观察结果

对照组大鼠视网膜内核层细胞形态规则，核仁清晰，核膜光滑，核质分散均匀；模型组大鼠视网膜内核层细胞体积缩小，细胞内大量空泡结构，核膜肿胀溶解，核浓缩；青蒿琥酯治疗组大鼠视网膜内核层细胞形态改善，核内染色质边集，空泡结构减少，细胞核形态逐渐规整（图2）。

2.3 青蒿琥酯对视网膜组织SOD、CAT 活性及MDA含量的影响

SOD：对照组与模型组SOD 活性比较，差异有统计学意义（t=30.229，P=0.000）。青蒿琥酯低、高浓度组SOD 活性与模型组比较，差异均有统计学意义（tALG=8.128，P=0.000；tAHG=11.131，P=0.000）。

图1 各组视网膜病理结构变化结果（HE 染色×400）。1A 对照组；1B 模型组；1C 青蒿琥酯低浓度组；1D 青蒿琥酯高浓度组

图2 大鼠视网膜内核层细胞透射电镜观察结果（×10，000）。2A 对照组：细胞核形态规整2B 模型组：细胞内大量空泡结构；2C 青蒿琥酯低浓度组：细胞核内染色质边集；2D 青蒿琥酯高浓度组：细胞核形态相对规整大鼠视网膜组织病理改变

CAT：对照组与模型组CAT 活性比较，差异有统计学意义（t=11.133，P=0.000），青蒿琥酯低、高浓度组CAT 活性与模型组比较，差异均有统计学意义（tALG=30.229，P=0.000；tAHG=13.914，P=0.000）。

MDA：对照组与模型组MDA 含量比较，差异有统计学意义（t=11.580，P=0.000），青蒿琥酯低、高浓度组MDA 含量与模型组比较，差异均有统计学意义（tALG=6.119，P=0.000；tAHG=11.639，P=0.000）（表1）。

表1 各组SD 鼠视网膜组织SOD、CAT 活性及MDA 含量（，n=12)

表1 各组SD 鼠视网膜组织SOD、CAT 活性及MDA 含量（，n=12)

注：* 与对照组比较，P<0.05；# 与模型组比较，P<0.05

2.4 Caspase-3、Caspase-9 蛋白表达水平比较

Caspase-3：对照组与模型组的Caspase-3 蛋白比较，差异有统计学意义（t=25.947，P=0.000）。青蒿琥酯低浓度组与模型组的Caspase-3 蛋白比较，差异有统计学意义（t=10.630，P=0.000）；青蒿琥酯高浓度组与模型组Caspase-3 蛋白比较，差异有统计学意义（t=17.752，P=0.000）。

Caspase-9：对照组与模型组的Caspase-9 蛋白比较，差异有统计学意义（t=28.271，P=0.000）；青蒿琥酯低浓度组Caspase-9 蛋白与模型组比较，差异有统计学意义（t=22.320，P=0.000）；青蒿琥酯高浓度组Caspase-9 蛋白与模型组比较，差异有统计学意义（t=17.426，P=0.000）（表2、图3）。

表2 各组大鼠视网膜组织Caspase-3、Caspase-9 蛋白检测结果（，n=12)

表2 各组大鼠视网膜组织Caspase-3、Caspase-9 蛋白检测结果（，n=12)

注：* 与对照组比较，P<0.05；# 与模型组比较，P<0.05

图3 Western blot 检测各组视网膜组织中Caspase-3、Caspase-9 蛋白表达。3A 对照组；3B 模型组；3C 青蒿琥酯低浓度组；3D青蒿琥酯高浓度组

3 讨论

视网膜缺血再灌注损伤引起视网膜组织能量代谢等失衡，氧供应不足导致视网膜组织血液供应降低，最终引起神经细胞不可逆损伤[5]。中西医结合治疗对视网膜缺血再灌注损伤有较好效果[6]。中药具有来源广泛、价格低廉、副作用少的特点，其中青蒿琥酯是青蒿素的一种衍生物，主要来源于植物黄花蒿的叶子。通过抗氧化作用可以抑制多种疾病的发生，是天然抗氧化剂，该药对视网膜保护作用引起了研究者的广泛关注[7]。研究证实，青蒿琥酯对糖尿病视网膜病变具有一定的治疗作用[8]。李铁英[9]通过建立1 型糖尿病大鼠模型，发现青蒿琥酯可以减少糖尿病视网膜细胞凋亡，增强大鼠视网膜组织中细胞保护因子热休克蛋白27 和抗凋亡因子Bcl-2 表达。

本研究采用升高眼压法制备大鼠缺血再灌注视网膜损伤动物模型，模拟临床视网膜缺血再灌注发生机制，进一步探讨青蒿琥酯对缺血再灌注大鼠视网膜组织的保护作用。组织学观察结果显示，青蒿琥酯干预后能明显改善视网膜内核层及外核层细胞形态，改善视网膜病理损伤。在视网膜缺血再灌注过程中，可出现能量代谢失衡，抗氧化物酶表达代谢异常。SOD、CAT 和MDA 是氧化应激的标志性物质，SOD 活性与CAT 水平及MDA 含量是相辅相成的。其中，SOD可以消除组织细胞脂质过氧化，CAT 能够抑制膜磷脂过氧化，MDA 的含量是反映细胞膜过氧化作用强弱的一个指标。视网膜组织缺血时引起氧自由基升高，抑制了消除自由基的酶活性，使氧自由基浓度进一步升高，加重视网膜损伤[10-11]。本实验中，青蒿琥酯低、高浓度组SOD 和CAT 活性显著升高，MDA 含量显著降低，提示青蒿琥酯能够改善视网膜损伤的氧化应激状态。细胞凋亡具有复杂的分子生物学特征，凋亡过程中清除了异常细胞，保证了生物体内环境的稳定，为促进系统发育发挥作用。Caspase 家族包括一系列在介导细胞炎症、应激和凋亡过程中起关键作用的酶。本研究显示，青蒿琥酯治疗组可降低缺血视网膜组织Caspase-3、Caspase-9 蛋白的表达，提示青蒿琥酯过抑制凋亡相关蛋白表达发挥保护视网膜组织作用。

综上所述，青蒿琥酯对视网膜组织具有一定的保护作用，除了保护视网膜形态（细胞形态及视网膜厚度）外，还可以通过抑制Caspase-3、Caspase-9表达降低SD 大鼠体内氧化应激反应。