TGF-β1对大鼠肾小球系膜细胞纤维化蛋白及长链非编码RNA uc.412表达的影响

杨思慧，王锦，黄婵，安梦如，张爱青，甘卫华

南京医科大学第二附属医院，南京210003

慢性肾脏病（CKD）是由多种原因引起的慢性肾脏结构及功能障碍，肾纤维化是其主要病理学基础。转化生长因子β1（TGF-β1）具有调节细胞生长、分化、凋亡和迁移等多种生物学活性，能够介导肾小球系膜纤维化，是肾脏纤维化发病机制中的关键介质［1-3］。Smad蛋白是TGF-β下游的主要效应蛋白，在肾脏受到各种病理性因素（缺血、缺氧或高糖等）和外界环境诱导因素时，活化的TGF-β1结合Ⅰ型和Ⅱ型TGF-β受体以及受体相关Smad（R-Smad），即Smad2和Smad3；磷酸化的Smad2/3与Smad4形成低聚物，进入细胞核调控下游靶基因的转录，诱导纤维化相关蛋白α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及胶原蛋白（Collagen）形成，进一步诱导肾小管上皮—间充质转化（EMT），从而促进肾纤维化［4-5］。长链非编码RNA（lncRNA）虽然不参与编码蛋白质，但可作为重要的调控分子发挥多种生物学功能，在某些细胞的增殖调控中发挥重要作用［6］。本课题组前期通过高通量lncRNA微矩阵芯片技术在TGF-β1处理的系膜细胞中筛选出lncRNA uc.412，证实其表达与系膜细胞增殖密切相关，但其在系膜细胞中的具体生物学功能尚不明确［7-9］。SIS3是Smad3磷酸化特异性抑制剂，2020年6—11月，本研究采用SIS3抑制TGF-β1诱导的Smad3磷酸化，观察TGF-β1诱导大鼠肾小球系膜细胞纤维化蛋白表达的作用，并进一步探讨其作用机制与lncRNA uc.412的关系，为临床防治肾纤维化相关的CKD奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂 大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1细胞株购自中国典型培养物保藏中心。过表达慢病毒lncRNA uc.412购自上海吉凯基因科技有限公司，1型胶原蛋白（Collagen-1）、α-SMA抗体购自美国Abcam公司，TGF-β1购自Novoprotein公司，SIS3购自MCE公司，低糖DMEM培养基、胎牛血清和胰蛋白酶购自Gibco公司，GAPDH购自Affinity公司，二抗兔IgG、二抗鼠IgG、BCA蛋白定量试剂盒购自凯基生物，TRIzol试剂购自Invitrogen公司，PCR试剂盒购自TaKaRa公司，PCR引物由上海锐真生物合成。

1.2 细胞培养 将HBZY-1细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养基（含100 U/L青霉素、100 mg/L链霉素）中，37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。每天于倒置显微镜下观察细胞形态，2～3 d更换培养基，当细胞融合率达到80%～90%时，加入0.25%胰酶进行消化传代。当细胞长至60%～70%融合时，用无血清培养基继续培养24 h，使细胞生长同步化。取对数生长期细胞用于后续实验。

1.3 细胞lncRNA uc.412表达检测 采用Real-time PCR法。取对数生长期细胞，按（2～8）×105/孔接种至6孔板，随机分为对照组、TGF-β1组、TGF-β1+SIS3组。对照组仅加入培养基，TGF-β1组加入10 ng/mL TGFβ1，TGF-β1+SIS3组同时加入10 ng/mL TGF-β1和1µmol/L SIS3，继续培养24 h。收集各组细胞，TRIzol法提取总RNA，逆转录合成cDNA。配置10µL PCR反应体系，以β-actin作为内参，参照PCR试剂盒说明书进行Real-time PCR。引物序列：lncRNA uc.412上游5'-CTTGAATTCCAAGCAGCA⁃CA-3'，下游5'-CAGCAATTAATCCCCCAAGA-3'；βactin上游5'-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3'，下游5'-TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。反应体系（20µL）：SYBR 5µL，上下游引物各0.4µL，Rox 0.2µL，cDNA 1µL，ddH2O 3µL。反应条件：预变性95℃30 s；变性95℃5 s；退火60℃34 s；延伸60℃1 min，40个循环；降温50℃30 s。通过熔解曲线分析扩增产物的特异性，2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。每个样本设置3个复孔，实验重复3次。

1.4 细胞Collagen-1、α-SMA及p-Smad3表达检测采用Western blotting法。细胞分组与干预方法同“1.3”。收集各组细胞，加入蛋自裂解液冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min离心15 min，取上清液。BCA法进行蛋白定量，加入5×上样缓冲液，变性处理（95℃，10 min）。取30µg蛋白上样，10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，湿转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h。加入一抗（稀释比例为1∶1 000）4℃孵育过夜，TBST缓冲液洗涤3次；加入二抗（稀释比例为1∶2 000）室温孵育1 h，TBST缓冲液洗涤3次。加入ECL发光液显色，凝胶成像系统图像扫描，Image J软件测定灰度值。以GAPDH作为内参，计算目的蛋白与GAPDH蛋白灰度值的比值，作为目的蛋白的相对表达量。

1.5 过表达lncRNA uc.412对肾小球系膜细胞纤维化蛋白表达的影响观察

1.5.1 细胞分组与慢病毒转染 取对数生长期细胞，接种于6孔板，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。待细胞融合率达到60%～70%，加入无血清DMEM培养基继续培养24 h，使细胞生长同步化。将细胞分为对照组、过表达组和病毒空载组，过表达组加入lncRNA uc.412过表达病毒液，病毒空载组加入不含lncRNA uc.412的慢病毒液，对照组加入等量培养基，继续37℃培养24 h。

1.5.2 细胞Collagen-1、α-SMA mRNA表达检测采用Real-time PCR法。PCR引物序列：α-SMA上游5'-AACTATGCTTCTGGACGTACAA-3'，下 游5'-CATAGCCCTCATAGATAGGCAC-3'；Collagen-1上游5'-AAAGATGGACTCAACGGTCTC-3'，下游5'-CAG⁃GAAGCTGAAGTCATAACCA-3'。具体操作步骤参照“1.3”。

1.5.3 细胞Collagen-1、α-SMA蛋白表达检测 采用Western blotting法。具体操作步骤参照“1.4”。

1.6 统计学方法 采用GraphPad Prism8统计软件。计量资料以±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞lncRNA uc.412表达比较 见表1。与对照组比较，TGF-β1组lncRNA uc.412表达升高；与TGF-β1组比较，TGF-β1+SIS3组lncRNA uc.412表达下降（P均<0.01）。

表1 各组细胞lncRNA uc.412表达水平比较（±s）

表1 各组细胞lncRNA uc.412表达水平比较（±s）

注：与对照组相比，*P<0.01；与TGF-β1组相比，#P<0.01。

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2.2 各组细胞Collagen-1、α-SMA及p-Smad3蛋白表达比较 见表2。与对照组比较，TGF-β1组细胞Collagen-1、α-SMA及p-Smad3蛋白表达升高（P均<0.05）；与TGF-β1组 比 较，TGF-β1+SIS3组 细 胞Collagen-1、α-SMA及p-Smad3蛋白表达下降（P均<0.05）。

表2 各组细胞Collagen 1、α-SMA及p-Smad3蛋白表达水平比较（±s）

表2 各组细胞Collagen 1、α-SMA及p-Smad3蛋白表达水平比较（±s）

注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与TGF-β1组相比，#P<0.05，##P<0.01。

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2.3 过表达lncRNA uc.412对细胞纤维化蛋白及mRNA的影响 见表3。与对照组相比，病毒空载组Collagen-1、α-SMA蛋白及mRNA表达无明显变化（P均>0.05），过表达组Collagen-1、α-SMA蛋白及mRNA表达均升高（P均<0.05）。

表3 各组细胞Collagen-1、α-SMA蛋白及mRNA表达水平比较（±s）

表3 各组细胞Collagen-1、α-SMA蛋白及mRNA表达水平比较（±s）

注：与对照组、病毒空载组相比，*P<0.05。

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3 讨论

了解肾纤维化的分子发病机制，对开发CKD的新型治疗策略有重要作用。肾脏纤维化是一个复杂的过程，主要病理表现为细胞外基质沉积和纤维细胞过度增殖，共同导致肾间质、肾小球硬化及慢性炎症细胞浸润，引起各种诱因导致的慢性肾脏疾病［10］。研究表明，进行性肾纤维化是由多种介质通过多种途径介导的，包括生长因子、细胞因子、代谢毒素和应激分子等，其中TGF-β1是肾脏纤维化的发病机制中的关键介质。TGF-β1是TGF-β超家族的成员，具有调节细胞生长、分化、凋亡和迁移等多种生物学过程［11］。本研究结果显示，肾小球系膜细胞中加入TGF-β1处理后，纤维化相关蛋白Collagen-1、α-SMA蛋白表达升高，证实TGF-β1可以诱导肾小球系膜纤维化。

lncRNA在某些细胞的增殖调控中发挥重要作用。近年来，关于lncRNA与肾脏疾病的研究越来越多，已有文献报道lncRNA参与肾纤维化［12］。FENG等［13］报道，在输尿管梗阻性肾病（UUO）和抗肾小球基底膜肾小球性肾炎（抗GBM-GN）小鼠中，发现151个Smad3依赖性的lncRNA，其中Erbb4-IR是通过下调Smad7来导致TGF-β/Smad3介导肾纤维化。WANG等［14］报道，TGF-β/Smad3相互作用长非编码RNA（lnc-TSI）受Smad3转录调控，并特异性抑制TGF-β诱导的Smad3磷酸化和下游纤维化基因表达，从而阻止Smad3与独立于Smad7的TGF-β受体1相互作用，抑制肾脏纤维化。因此，研究lncRNA对于治疗肾纤维化导致的慢性肾脏疾病具有重要意义。lncRNA uc.412基因全长268 bp，位于人类17号染色体q12片段，其表达水平与系膜细胞增殖程度有关。本研究结果显示，肾小球系膜细胞加入TGF-β1后，与对照组相比，TGF-β1组lncRNA uc.412表达明显上调；建立过表达lncRNA uc.412的系膜细胞模型，发现过表达组纤维化相关蛋白Collagen-1、α-SMA蛋白及mRNA表达均显著增加。这表明lncRNA uc.412参与介导肾小球系膜纤维化，但TGF-β1通过lncRNA uc.412调控系膜纤维化的机制有待进一步研究。

Smad蛋白家族是TGF-β下游的主要效应蛋白，在肾脏受到各种病理性因素（如缺血、缺氧或高糖等）和外界环境诱导因素影响时，TGF-β受体被激活，与下游底物Smad蛋白家族结合，形成复合体转移入细胞核，调控下游基因转录，进一步诱导肾小管上皮间充质转化，从而促进肾纤维化。其中Smad3是有效的致纤维化因子，敲除Smad3有效减轻肾脏纤 维 化［1］。XU等［15］发 现，敲 除Smad3可 降 低lncRNA Erbb4-IR转录，同时增加miR-29b转录，保护小鼠肾脏免受进行性肾损伤，Smad3可能成为糖尿病肾病的新型有效治疗靶标。ZHOU等［16］在Smad3野生型/敲除型的小鼠上构建单侧输尿管结扎诱导的肾脏纤维化模型，发现lncRNA np_5318和np_17856参与了TGF-β1介导的肾纤维化，并可能成为肾脏纤维化的潜在治疗靶点。因此推测，TGF-β1可能通过与下游Smad3信号通路上调lncRNA uc.412，进而促进系膜细胞纤维化相关蛋白表达。SIS3是Smad3的特异性抑制剂，可抑制TGF-β1诱导的Smad3磷酸化。JI等［17］研究发现，SIS3通过抑制单侧输尿管结扎小鼠肾脏中的TGF-β/Smad3信号转导通路，改善了肾组织纤维化、细胞凋亡及炎症。本研究结果显示，与TGF-β1组比较，TGF-β1+SIS3组p-Smad3水平下调，证实SIS3能特异性抑制Smad3磷酸化；用SIS3干预后，与TGF-β1组相比，TGF-β1+SIS3组Collagen-1、α-SMA蛋白及mRNA表达显著降低，证实TGF-β1通过Smad3信号途径诱导系膜细胞纤维化蛋白表达增加；与TGF-β1组相比，TGF-β1+SIS3组系膜细胞lncRNA uc.412表达降低，提示TGF-β1可以通过Smad3信号通路上调lncRNA uc.412表达，从而参与肾小球系膜纤维化的进程。

综上所述，TGF-β1能够诱导肾小球系膜纤维化，其作用机制可能是通过Smad3信号通路上调lncRNA uc.412表达从而发挥作用，提示lncRNA uc.412可能具有治疗CKD的潜在前景，但其具体机制仍有待进一步深入研究。