Let-7f-5p对糖尿病大鼠心肌微血管病变的影响及机制

黄河，周瑞，刘星，刘应才

西南医科大学附属医院，四川泸州646000

心肌组织具有极其丰富的毛细血管网，能够显著影响心肌灌注。糖尿病心肌微血管病变造成心肌微血管密度减少，引起心脏灌注不足，导致心血管不良事件的发生［1］。因此，治疗糖尿病微血管病变、改善心肌微血管功能对于建立缺血心肌侧支循环、改善患者预后十分重要。但目前对糖尿病微血管病变尚无有效的治疗措施。有研究显示，局部补充血管内皮生长因子（VEGF）可增加糖尿病心肌微血管密度，改善心功能［2-3］。微小RNA（miRNA）是一种单链、非编码的内源性非编码RNA，其主要作用是通过降解mRNA或翻译抑制，从而在转录后调节基因的表达。在心血管系统中，miRNA通过调节基因表达在心肌细胞生长、心率维持、血管生成方面起重要作用［4］。Let-7是目前研究最广泛的mi RNA家族之一，其在心血管系统中高度表达，与心脏肥厚、心脏纤维化等病理过程以及扩张型心肌病、心肌梗死、心律失常、高血压病等心血管疾病密切相关［5］。同时，Let-7可调控血管生成，Let-7能够以Argonaute蛋白1（AGO1）为靶点介导VEGF的产生，即Let-7/AGO1/VEGF信号通路，最终促进血管生成［6-7］。但Let-7/AGO1/VEGF信号通路是否在糖尿病心肌微血管病变中同样能起到血管生成作用，从而改善心肌微血管病变，目前尚不明确。Let-7f-5p是Let-7家族成员，其与心肌缺血、维持血管完整性等关系密切，但其在糖尿病微血管病变中的作用鲜见报道。我们的前期研究显示，糖尿病大鼠心肌组织Let-7f-5p表达较正常对照组明显下降［8］。2019年10月—2020年4月，我们通过腺病毒转染的方式分别上调和下调糖尿病大鼠心肌组织Let-7f-5p表达，观察AGO1和VEGF在mRNA及蛋白水平的变化，观察Let-7f-5p对心肌微血管病变的影响并探讨可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级健康雄性SD大鼠25只，6～8周龄，体质量（200±20）g，购自西南医科大学实验动物中心。饲养房空气流通，温度22～26℃，光照时间12 h/d。普通饲料，自由饮水，适应性喂养1周后用于实验。

1.1.2 主要试剂与仪器 Let-7f-5p过表达及干扰表达腺相关病毒载体委托北京迈津生物科技公司构建。空病毒原液构自北京迈津生物科技公司。罗氏血糖仪、血糖试纸（德国罗氏公司）；链脲佐菌素（STZ，Sigma公司）；兔来源CD31抗体（Afinity公司）；总RNA提取试剂、RT-PCR反转录试剂盒、SYBR Green PCR试剂盒（ELK Biotechnology）；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、RIPA总蛋白裂解液、BCA蛋白质浓度测定试剂盒、ECL化学发光检测试剂盒、苏木素染液、伊红染液（ASPEN公司）。GE Vivi-E9心血管超高端彩超（美国GE公司）；病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；荧光定量PCR仪（Life technolo⁃gies）；电泳仪（北京市六一仪器厂）；酶标仪（Diatek公司）；普通光学显微镜（OLYMPUS公司）。

1.2 动物分组与模型建立 将大鼠随机分为正常对照组5只和糖尿病模型组20只。正常对照组实验全程予以自由饮水、常规饲料喂养。糖尿病模型组给予高脂高糖饲料（配方为10%猪油、20%蔗糖、6%蛋白粉、3%蛋黄粉、61%常规饲料）喂养4周后，禁食12 h，腹腔注射40 mg/kg STZ；注射72 h后，使用罗氏快速血糖仪行尾静脉血糖检测，以3次随机血糖值>16.7 mmol/L为糖尿病大鼠模型构建成功。取造模成功的大鼠15只，随机分为空病毒组、Let-7f-5p过表达组、Let-7f-5p抑表达组，每组各5只。

1.3 干预方法 Let-7f-5p过表达组尾静脉一次性注射Let-7f-5p过表达病毒原液50µL，Let-7f-5p抑表达组尾静脉一次性注射Let-7f-5p抑制表达病毒原液50µL，空病毒组尾静脉一次性注射等体积空病毒原液。随后三组大鼠继续自由饮水、高脂高糖饲料喂养12周。

1.4 心脏功能检查 所有大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉，剪去胸前区毛发，涂抹适量医用超声耦合剂，使用彩色多普勒超声显像仪（GE Vivid E9）进行心脏超声检查。探头频率3.5 MHz，记录左心室舒张末期内径（LVIDd）、左心室收缩末内径（LVIDs），计算左心室射血分数（LVEF）、左心室缩短分数（FS）。

1.5 标本采集 大鼠固定，开胸取出心脏，剪去多余血管和心房组织。取左心室心肌组织，分成约5 mm×5 mm×3 mm若干小块，一部分加入4%多聚甲醛固定，用于免疫组化；另一部分置于-80℃冰箱保存，用于RT-PCR和Western blotting检测。

1.6 心肌毛细血管密度检测 采用兔来源CD31单抗免疫组化染色。取4%多聚甲醛固定的心肌组织，石蜡包埋，常规脱蜡、水化，取心肌横切面切片，置于3%H2O2中，室温避光孵育。加入兔来源CD31一抗50µL，4℃过夜。每张切片加100µL HRP标记山羊抗兔二抗，37℃孵育50 min。DAB染色，苏木素复染。显微镜下观察抗CD31抗体染色阳性的心肌毛细血管数量。从每个切片中随机选取5个区域，由两名经验丰富的观察者计数毛细血管数量和心肌细胞核，计算毛细血管数量/心肌细胞核比值（C/M），取平均值用于评估心肌毛细血管密度。

1.7 心肌组织Let-7f-5p及AGO1、VEGF mRNA表达检测 采用RT-PCR法。取冻存心肌组织约20 mg，加入1 mL预冷的TRIpure充分研磨，至心肌组织全部溶解。采用TRIzol法提取心肌组织RNA，反转录合成cRNA。以cDNA为模板，使用StepOne™Real-Time PCR仪进行PCR扩增。引物序列见表1。反应体系：2×Master Mix 5µL，2.5µmol/L引物工作液1µL，Template 1µL，ddH2O 2µL，ROX参比染料1µL。反应条件：95℃预变性10 min；95℃15 s，60℃60 s，共40个循环。采用2-ΔΔct法计算目的基因的相对表达量，let-7f-5p以U6为内参进行计算，AGO1、VEGF mRNA以GAPDH为内参进行计算。

表1 目的基因及内参引物序列

1.8 心肌组织AGO1、VEGF蛋白表达检测 采用Western blotting法。取心肌组织匀浆，加入适当细胞总蛋白提取试剂，振荡、吹打，使细胞完全裂解。4℃、13 000 g离心5 min，收集上清液，使用BCA法测定蛋白浓度。根据样品浓度确定上样量，保证每个样品总蛋白上样量均为40µg。将处理完毕的蛋白样品通过电泳电转至PVDF膜上，加入封闭液，室温封闭1 h。加入一抗（稀释比例1∶1 000）4℃过夜。TBST冲洗，加入二抗（稀释比例1∶10 000），室温孵育30 min。TBST冲洗。滴加新鲜配制的ECL混合溶液到膜的蛋白侧，暗室中曝光。根据不同的光强度调整曝光条件，显影、定影。将胶片进行扫描存档，AlphaEaseFC软件处理系统分析目标带的光密度值，用GAPDH条带进行灰度值校正。以各条带与GAPDH条带的吸光度之比计算目的蛋白的相对表达量。

1.9 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），进一步两两比较采用Dunnett-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组心脏功能指标比较 与对照组相比，空病毒组、Let-7f-5p过表达组、Let-7f-5p抑表达组LVIDd、LVIDs、LVEF、FS均降低（P均<0.05）。Let-7f-5p过表达组LVIDd、LVIDs、LVEF、FS较空病毒组增加，Let-7f-5p抑表达组LVIDd、LVIDs、LVEF、FS较空病毒组降低（P均<0.05）。见表2。

2.2 各组心肌微血管密度比较 空病毒组、Let-7f-5p过表达组、Let-7f-5p抑表达组、对照组C/M分别为0.48±0.07、0.66±0.05、0.28±0.05、1.49±0.28。与对照组比较，其他三组C/M均降低；与空病毒组比较，Let-7f-5p过表达组C/M增加，Let-7f-5p抑表达组C/M降低（P均<0.05）。

表2 各组心脏功能指标比较（±s）

表2 各组心脏功能指标比较（±s）

注：与对照组比较，*P<0.05；与Let-7f-5p过表达组比较，#P<0.05；与空病毒组比较，△P<0.05。

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2.3 各组心肌组织中Let-7f-5p及AGO1、VEGF mRNA表达水平比较 与对照组相比，空病毒组、Let-7f-5p抑制表达组心肌组织Let-7f-5p及VEGF mRNA表达均降低，AGO1 mRNA表达升高（P均<0.05）；与空病毒组比较，Let--7f-5p抑表达组心肌组织Let-7f-5p及VEGF mRNA表达降低，AGO1 mRNA表达升高（P均<0.05）；Let-7f-5p过表达组心肌组织Let-7f-5p及VEGF mRNA表达升高，AGO1 mRNA表达降低（P均<0.05）。见表3。

表3 各组心肌组织中Let-7f-5p、AGO1、VEGF mRNA表达比较（±s）

表3 各组心肌组织中Let-7f-5p、AGO1、VEGF mRNA表达比较（±s）

注：与对照组比较，*P<0.05；与Let-7f-5p过表达组比较，#P<0.05；与空病毒组比较，△P<0.05。

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2.4 各组心肌组织AGO1、VEGF蛋白表达水平比较 与对照组比较，空病毒组心肌组织AGO1蛋白表达升高，VEGF蛋白表达降低（P均<0.05）；与空病毒组比较，Let-7f-5p过表达组心肌组织AGO1蛋白表达降低、VEGF表达升高，Let-7f-5p抑表达组心肌组织AGO1蛋白表达升高、VEGF表达降低（P均<0.05）。见表4。

表4 各组心肌组织中AGO1及VEGF蛋白表达比较（±s）

表4 各组心肌组织中AGO1及VEGF蛋白表达比较（±s）

注：与对照组比较，*P<0.05；与Let-7f-5p过表达组比较，#P<0.05；与空病毒组比较，△P<0.05。

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3 讨论

糖尿病微血管病变可导致心肌灌注不足、心肌能量代谢障碍、心肌肥厚、心室壁硬度增加、心肌收缩和舒张功能障碍等心肌结构和功能障碍，最终导致心力衰竭的发生［9］。VEGF是影响血管生成的主要因素，血管内皮细胞在VEGF的作用下，迁移至血管周围间隙，再通过黏附、分裂、增殖、重构等过程，最终形成新生的毛细血管［10］。ISNER等［11-12］报道，对下肢慢性缺血性闭塞患者通过肌肉内注射或球囊直接血管内给药的方式局部补充VEGF，可促进缺血区域的侧支循环形成，改善远端肢体血流，表明通过局部补充VEGF可以改善缺血组织病变。在糖尿病大鼠模型中，增加心脏中VEGF的表达后，大鼠心肌微血管密度增加，心肌血流量提高，最终改善了心脏功能［2-3，13］。这表明局部增加心肌中VEGF的表达可能是糖尿病微血管病变潜在的治疗方向。

本研究结果显示，与对照组比较，LVIDd、LVIDs、LVEF、FS均降低，表明表现为心脏收缩功能减弱，出现了心脏功能障碍；CD31单抗免疫组化染色显示，心肌微血管密度降低，提示心肌细胞在高血糖环境中受损，证实了糖尿病心肌微血管病变的存在。与空病毒组比较，Let-7f-5p过表达组心肌微血管密度增加，且心脏超声结果提示心脏收缩功能好转；而Let-7f-5抑表达组大鼠心肌微血管密度更加稀疏，心脏收缩功能恶化，说明心肌Let-7f-5p可影响糖尿病心肌微血管病变，最终影响心脏功能。

Let-7/AGO1/VEGF是一条促进血管生成的信号通路。有研究显示，在缺氧情况下，Let-7可靶向抑制AGO1表达。AGO1蛋白属于AGO蛋白家族，在真核细胞中miRNA与AGO蛋白结合，最终形成RNA诱导的沉默复合体（RISC），RISC再通过靶向调控mRNA，从而对基因进行转录后的负性调控［14］。AGO1蛋白是AGO蛋白家族成员，是调控血管内皮细胞内VEGF mRNA转录和蛋白质合成的关键蛋白［15-17］。其表达抑制导致VEGF mRNA表达上调，VEGF蛋白表达增加，从而使血管生成增多［6-7］。CHEN等［7］研究发现，缺氧状态下血管内皮细胞中Let-7a、Let-7f等Let-7家族成员miRNA表达明显上调，VEGF mRNA表达增加；通过生物信息学预测发现，AGO1可能是中间重要的调控位点；分别抑制Let-7表达及过表达AGO1后均可减弱内皮细胞中VEGF的表达。通过动物实验进行验证后，最终发现Let-7/AGO1/VEGF信号通路的存在，即当上调Let-7表达后，AGO1表达降低而VEGF表达增加，最终导致血管生成增加。ZHU等［6］发现，低氧处理的人脂肪来源干细胞细胞外囊泡中Let-7f-5p、Let-7a-5p、Let-7i-5p、Let-7c-5p表达增加，进一步阻断Let-7家族表达，检测AGO1、VEGF mRNA/蛋白的表达并评估体外促血管生成能力，最终表明Let-7/AGO1/VEGF信号通路可调控血管生成。本研究结果显示，与对照组比较，空病毒组心肌AGO1 mRNA和蛋白表达升高，VEGF表达降低，表明AGO1蛋白可能通过参与RISC的形成，调控VEGF的表达。与空病毒组比较，Let-7f-5p过表达组心肌AGO1 mRNA和蛋白表达均降低，VEGF mRNA和蛋白表达升高，而Let-7f-5p抑制表达组的检测结果相反，AGO1 mRNA和蛋白表达水平均升高，VEGF mRNA和蛋白水平降低。这表明上调Let-7f-5p表达可通过抑制AGO1蛋白表达从而增加心肌VEGF表达，增加心肌微血管密度，改善糖尿病大鼠的心脏功能。

综上所述，Let-7f-5p可能通过Let-7/AGO1/VEGF信号通路调控影响糖尿病大鼠心肌微血管病变，其表达上调可增加糖尿病心肌微血管密度，改善心脏功能，为糖尿病心肌微血管病变的靶向治疗提供了思路和方向。