基于蛋白相互作用网络的帕金森病相关信号通路关键蛋白的筛选

马素亚，杜相宜，时晶

北京中医药大学东直门医院，北京100007

帕金森病（PD）是一种以黑质纹状体多巴胺能神经元变性为特征的进行性神经退行性疾病，临床表现以运动症状为核心，伴随一系列非运动症状，晚期可出现认知和精神障碍。其病理改变主要是中脑黑质致密部多巴胺能神经元减少，导致黑质纹状体多巴胺含量降低。大脑中的多种信号转导途径与PD的发生密切相关［1］。本研究通过总结PD相关信号通路研究文献，构建PD信号通路蛋白相互作用网络，并使用cytoscape拓扑分析筛选PD信号通路蛋白相互作用网络关键蛋白，从细胞分子水平为PD的治疗提供理论支持和研究方向。

1 资料与方法

1.1 PD相关信号通路的筛选 通过计算机检索中国知网、维普、PubMed数据库，筛选PD信号通路相关研究，研究类型不限，检索时间自各个数据库建库至2021年3月。检索中文关键词为“帕金森”和“信号通路”，英文关键词为“Parkinson's disease”和“sig⁃naling pathway”。文献纳入标准：研究类型为临床实验或动物实验或细胞实验；研究疾病是PD；研究内容为信号通路。排除综述、评论性文章、会议论文。信号通路纳入标准：经筛选后研究文献篇数≥5篇。

1.2 PD相关信号通路信息图的获取 在对PD信号通路文献检索后，使用BioCarta Pathway、CST、PathBank信号通路数据库及文献，下载完整信号通路信息图。

1.3 PD信号通路蛋白相互作用网络的构建与关键蛋白的筛选 在信号通路文献及完整信号通路图的基础上，筛选各信号通路主要蛋白，蛋白简写使用Uniprot数据库矫正。将筛选出的信号通路关键蛋白导入STRING数据库，使用“Multiple proteins”选项，种属限制为“Homo sapiens”。在得出结果后，导出.tsv格式文件至cytoscape软件，构建信号通路蛋白相互作用网络图。使用拓扑分析，得出信号通路蛋白相互作用网络关键蛋白。

2 结果

2.1 PD信号通路筛选结果 文献检索结果中，PubMed 730篇，中国知网361篇，维普85篇，共1 176篇。查重删除55篇，阅读题目及摘要后删除841篇，共筛选出280篇文献，涉及12条PD相关信号通路。选取通路文献数≥5的研究，纳入信号通路包括PI3K/AKT/mTOR信号通路、JNK信号通路、p38 MAPK信号通路、Wnt/β-catenin信号通路、Notch信号通路、SDF-1/CXCR4信号通路、NF-κB信号通路、JAK/STAT信号通路和Nrf2/ARE信号通路。见表1。

2.2 PD相关信号通路信息图 见OSID码。

2.3 PD相关信号通路蛋白相互作用网络图与关键蛋白的筛选结果 由STRING数据库构建的PD相关信号通路蛋白相互作用网络图见OSID码。经cytoscape拓扑分析得出蛋白相互作用网络前10位关键蛋白分别为AKT1、MAPK1、Jun、p53、MAPK8（JNK）、c-MYC、TNF、PTEN、STAT3、mTOR，节点度分别为62、57、57、56、52、50、49、44、42、41。与PD相关的信号通路关键蛋白的筛选结果见表2。

3 讨论

近年来PD在全球的发病率逐年上升，其增长速度已超过阿尔茨海默病，预计到2040年患者人数将达到1 420万［15］。PD患者黑质多巴胺能神经元变性和丢失，脑内多巴胺生成减少，但黑质神经元细胞变性的机制仍不明确。分析PD相关信号通路有助于探讨其发病机制，为PD的治疗提供理论依据。本研究结果显示，PI3K/AKT/mTOR信号通路是目前研究最多的信号通路，约占PD信号通路研究文献的34%，JNK通路、p38 MAPK通路、Wnt/β-catenin通路、Notch信号通路、Nrf2/ARE通路和NF-κB通路研究也较多，均为PD信号通路的热点通路。

表1 PD相关信号通路筛选结果

表2 PD相关信号通路关键蛋白筛选结果

PI3K/AKT/mTOR信号通路在中枢神经系统中广泛存在，参与中枢神经系统细胞存活、自噬、突触可塑性、神经发生、神经元增殖分化等生理过程。激活PI3K/AKT/mTOR通路可阻止细胞受到凋亡刺激，减少细胞凋亡［16］。

JNK信号通路是MAPK通路的重要组成部分，在细胞生长、凋亡和应激等过程中发挥重要作用。JNK作为应激激活蛋白激酶，可被炎症细胞因子、热休克以及紫外线照射等激活。激活的MAPK可作用于转录因子c-Jun、c-MYC、ATF2及抗调亡和促调亡蛋白等，发挥促细胞凋亡的作用［17］。

p38 MAPK信号通路是MAPK信号通路之一，与PD的发病密切相关。p38信号通路可促进细胞凋亡，与负性刺激相关，如应激、紫外线、渗透压变化和细胞因子等均为其刺激因子。被激活的p38可激活多种下游信号分子，如TNF、c-MYC、p53、c-Jun、Caspase等，从而发挥促凋亡作用［18］。

Wnt/β-catenin信号通路是进化过程相对保守的通路，在正常胚胎发育以及成年组织稳态维持中发挥重要作用，参与细胞分化、发育、凋亡等过程，与神经退行性疾病如PD密切相关［19］。Wnt配体与细胞膜表面卷曲蛋白（Fz）受体及辅助性低密度脂蛋白受体相关蛋白结合，激活Fz受体；活化的Fz受体作用于散乱蛋白，使GSK-3β磷酸化失活，导致其介导的β-catenin降解过程受抑制，β-catenin水平升高。部分β-catenin进入细胞核，与T细胞因子/淋巴细胞增强因子结合，引起下游靶基因的转录，促进多巴胺能神经元细胞增殖转化，维持多巴胺神经元的完整性［20］。

Notch信号通路具有高度保守性，在神经退行性疾病如PD中有重要作用，参与多种细胞生命活动，如细胞增殖、分化、凋亡等［21］。Notch受体与邻近细胞上的配体结合，激活信号通路，随后Notch蛋白发生水解，其胞内结构域NICD释放入细胞质，并转移到胞核，与胞核上的DNA结合蛋白CSL家族结合，形成转录因子，刺激靶基因转录，继而调节其下游的靶点基因，参与神经系统疾病的发生［10］。

SDF-1在神经系统发育以及脑损伤中具有重要的调节和趋化作用，SDF-1大量地、选择性地在发育的中枢神经系统中表达。CXCR4对维持中枢神经系统正常发育发挥重要作用，能促使神经元顺其梯度改变发生迁移［22］。SDF-1特异性地与CXCR4受体结合，通过CXCR4促进二聚体形成、空间构象改变、内化以及激活与其相偶联的G蛋白等机制，激活多种信号转导通路［23］。

NF-κB信号通路在神经系统免疫应答过程中起核心作用，是免疫反应的主要转录因子。异常的炎症反应是导致PD患者多巴胺能神经元丢失的主要因素之一，过度激活的NF-κB信号与PD的发病有关。在大多数细胞中，NF-κB与抑制性IκB蛋白偶联，以不活跃的状态存在于细胞质中；当信号通路被激活后，IκBα磷酸化和降解，释放NF-κB二聚体（p65∶p50）转位到细胞核，调节靶基因表达［24］。

JAK/STAT通路是一条特异性的细胞膜受体从激活到核基因表达的蛋白信号转导级联通路，可被多种细胞因子、生长因子以及激素所激活，广泛参与细胞的增殖、分化成熟、凋亡及免疫调节等过程［25］。JAK/STAT信号通路的异常激活会导致多种自身免疫性和神经炎症性疾病发生，如过表达α-SYN可导致PD［26］。JAK/STAT能够直接调节跨膜受体与细胞核的联系，STAT可被JAK磷酸化、二聚化，然后通过核膜转运进入细胞核，通过与特定的DNA元件结合来调控细胞因子应答基因的表达［13］。

Nrf2/ARE信号通路激活是PD的重要神经保护调节因子［27］。Nrf2是神经元生长的细胞内调节因子，Nrf2激活后，从细胞质转移到细胞核，启动抗氧化蛋白酶的表达。抗氧化蛋白酶主要包括血红素加氧酶1（HO-1）和NADPH醌氧化还原酶1（NQO1），HO-1和NQO1高表达可延缓神经退行性疾病的发展［28］。Nrf2可激活多种抗氧化反应元件（ARE）驱动的抗氧化基因，在体外和体内阻止氧化应激，是神经治疗学的多功能通路［29］。

本研究采用STRING数据库构建PD相关信号通路蛋白相互作用网络图，经cytoscape拓扑分析得出蛋白相互作用网络前10位关键蛋白分别为AKT1、MAPK1、Jun、p53、MAPK8（JNK）、c-MYC、TNF、PTEN、STAT3、mTOR。AKT又称蛋白激酶B，相对分子质量为57×103，大约由480个氨基酸残基构成，分为AKT1、AKT2、AKT3三种亚型。本研究结果显示，AKT1是PD蛋白相互作用网络最重要的蛋白。研究显示，AKT1活性减低与PD的发病密切相关，AKT1通过调控转录发挥作用［30］。细胞凋亡是多巴胺神经元损伤的重要原因，MAPK是神经元凋亡的强效因子，其过度激活可导致PD神经元死亡［31］。本研究结果显示，MAPK1、MAPK8均与PD的发生密切相关，MAPK1参与多种细胞过程，如细胞周期、细胞凋亡、细胞存活等，在PD病程进展过程中发挥一定作用［32］。MAPK8参与神经系统生理活动的主要是c-Jun N末端激酶。活化的MAPK8在淀粉样斑块形成、神经炎症、突触功能障碍中起重要作用，是神经退行性疾病的重要信号因子［33］。炎症因子TNF-α与其受体相结合可触发并启动Caspase家族介导的细胞凋亡，进一步加重PD的病理进展。c-Jun作为一种转录因子，可以调控其他基因的表达，在受到外界刺激激活后，可快速表达合成Jun蛋白，而Jun蛋白是脑内神经细胞活化的标志［34］。p53是一种细胞应激传感器，当p38MAPK通路激活后，可磷酸化p53，并使其核转运进而发挥作用［35］。ODUMPATTA等［36］研究发现，MYC作为主要的转录因子在PD发病过程中发挥重要作用。PTEN在神经系统中表达，作为一种脂磷酸酶可导致PIP3去磷酸化变成PIP2，抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路，导致神经细胞死亡。PTEN可以调节神经干细胞增殖及神经元分化及凋亡，与神经系统疾病的发生发展及预后密切相关［37］。研究显示，STAT3磷酸化后可促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，同时能促进血管生成，为新生神经元和突触提供营养作用［38］。mTOR是PI3K相关激酶家族成员，在自噬诱导中发挥具有重要作用，活化后的mTOR激酶可抑制自噬，抑制mTOR激酶活性能够激活自噬进程［39］。

综上所述，本研究对PD相关信号通路进行总结，利用生物信息学方法研究PD相关信号通路蛋白网络中关键信号蛋白，找出前10位关键信号蛋白为AKT1、MAPK1、Jun、p53、c-MYC、JNK、TNF、PTEN、STAT3和mTOR，从PD的细胞分子水平方面为PD的进一步研究提供了理论支持。