补肾活血方对抗磷脂综合征小鼠母胎界面VEGF、HIF‐1α、TGF‐β、sflt‐1蛋白表达影响研究①

韩永梅 刘蔚霞肖惠冬子 卫爱武（河南中医药大学，郑州 450000）

抗磷脂综合征（anti‐phosphoric syndrome，APS）是导致复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）的主要病因，以体内产生大量抗磷脂抗体（an-tiphospholipid antibodies，APL）为特征［1］。APL通过抑制前列腺素，增加胎盘血栓素，促使低密度脂蛋白被滋养细胞氧化，抑制滋养细胞分化，造成胎盘功能不全，导致流产［2］。母胎界面血管发生和血管化是胎盘蜕膜毛细血管网络构建的基础。研究表明RSA小鼠存在蜕膜血管减少、血管内皮细胞破坏等病理变化，血管生长因子失衡是导致RSA的重要原因之一［3‐5］。本文研究补肾活血方对抗磷脂综合征模型小鼠母胎界面VEGF、HIF‐1α、TGF‐β、sflt‐1蛋白表达的影响，探讨APS致RSA的发病机制及治疗机理。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物42只，6～8周龄BALB/c雌性小鼠，平均体重（20.00±0.20）g，购自辽宁长生生物技术股份公司，SPF级，许可证号：SCXK（辽）2015‐0001，屏障环境标准饲养，恒定湿度（40%～55%）及恒定温度（25±1℃），高压灭菌的水和标准饲料供动物自由食用。连续观察1周无异常者入组实验。实验研究过程严格遵守减量化、再利用和再循环的原则。本研究经河南中医药大学第一附属医院伦理委员会审查通过，伦理审查编号2009HL‐053‐03。

1.1.2 主要试剂与药品全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、一抗二抗去除液、SDS‐PAGE凝胶快速制备试剂盒、Western洗涤液、SDS‐PAGE蛋白上样缓冲液、HIF‐1α antibody、VEGF antibody、TGF‐β1 antibody、sflt‐1 antibody、羊抗兔IgG‐HRP、内参抗体β‐actin（万类生物有限公司）。补肾活血方药：菟丝子30 g、桑寄生15 g、续断15 g、阿胶15 g、当归10 g、熟地黄20 g、川芎6 g、党参20 g、白术15 g、海螵蛸12 g、藕节炭15 g、白芍30 g、炙甘草6 g，采用江阴天江药业有限公司生产的颗粒剂型，由河南中医药大学第一附属医院颗粒剂药房提供。肠溶阿司匹林片，北京中新药业股份有限公司生产，批准文号，国药准字H13023461，规格25 mg。

1.1.3 实验仪器水平摇床（北京六一，型号：WD‐9405B）、电泳仪（北京六一，型号：DYY‐7C）、转移槽（北京六一，型号：DYCZ‐40D）、超速冷冻离心机（湖南湘仪，型号：H‐2050R）、酶标仪（美国BIOTEK，型号：ELX‐800）、电热恒温培养箱（天津泰斯特，型号：DH36001B）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与造模方法将42只小鼠随机分为正常妊娠组、模型组、模型对照组、补肾活血高剂量组、补肾活血低剂量组、阳性对照组，每组动物数均为6只。模型组、高剂量组、低剂量组、阿司匹林组：造模第1天雌性小鼠宫腔内注射（采用自制的注射器，将毛细玻璃管进行均匀加热，将融化的尖端拉长至3 cm，直径为1 mm，然后将其连接到1 ml注射器，用石蜡密封。将小鼠麻醉后腹部消毒，剪开皮肤逐层分离暴露子宫，采用自制注射器进行宫腔内注射。注射完成后，逐层缝合伤口。）10 ug弗氏完全佐剂CFA乳化的人β2GP‐1进行免疫；第8天再次用弗氏不完全佐剂IFA乳化的10 ug人β2GP‐1免疫小鼠。模型对照组：造模第1天雌性小鼠宫腔注射等剂量的CFA进行免疫；第8天再次注射等剂量的IFA进行免疫。正常妊娠组：不行免疫。第18天将各组雌性小鼠与雄性小鼠连夜配对。第19天早上检测出阴道栓的雌鼠纳入实验，确定为实验开始第0天。各组小鼠颌下采血0.5 ml，应用ELISA方法检测血清抗β2糖蛋白抗体1抗体（anti‐β2GP‐1）；应用APTT检测试剂盒（高岭土激活）检测血浆活化部分凝血活酶时间（APTT）；应用血细胞自动分析仪检测静脉血血小板计数（PLT）。如小鼠anti‐β2GP‐1滴度明显升高，APTT明显延长，PLT明显降低，提示孕鼠抗磷脂综合征实验模型造模成功［6‐8］。

1.2.2 给药方法正常妊娠组、模型组、模型对照组等容量蒸馏水灌胃，每日1次。其余3组给药剂量参照徐叔云主编《药理实验方法学》（第三版）方法计算：小鼠20 g与70 Kg人换算关系是0.0026，计算低剂量组0.826 8 g/(kg·d)（相当于临床成人等效剂量1.5倍），高剂量1.653 6 g/(kg·d)（相当于临床成人等效剂量3倍）。阳性对照组肠溶阿司匹林片，按上法计算小鼠按0.585 mg/(kg·d)（相当于临床成人等效剂量3倍）给药，连续灌胃给药15 d，每天2次。

1.2.3 胚胎吸收率给药结束后将小鼠腹腔注射200 mg/kg戊巴比妥钠安乐处死，剪取子宫记录正常胚胎数和流产胚胎数，记录被吸收胚胎数和存活胚胎数。胚胎吸收率计算公式：R=Re/（Re+F）×100%（R表示胚胎吸收率，Re表示吸收胚胎数，F表示存活胚胎数）［9］。

1.2.4 Western blot检测每个样品剪取胎盘组织100 mg。提前将裂解液置于室温融化，估算实验所用体积进行分装，并混入分装体积1%的PMSF备用。根据每个样本的质量及体积加入相应体积的裂解样本，然后继续置于冰上静置5 min。开启低温冷冻离心机，12 000 r/min，4℃，离心10 min，分离上清为所得的蛋白质抽提物。然后进行蛋白质定量、SDS‐PAGE、转印至PVDF膜、封闭、孵育一抗、孵育二抗、ECL底物发光、图像保存。将胶片进行扫描，用凝胶图像处理系统（Gel‐Pro‐Analyzer软件）分析目标条带的光密度值。

1.2.5 胎盘组织HE染色取胎盘组织，生理盐水清洗后，采用10%中性甲醛液固定，再进行包埋、切片脱蜡至水、苏木素染色、盐酸酒精分化、自来水返蓝、伊红染色、脱水、透明、封片、镜检。制成小鼠胎盘组织病理切片，用×200显微镜下观察染色效果，进行拍照。

1.2.6 指标检测检测各组小鼠胚胎吸收率；各组小鼠胎盘病理形态、螺旋动脉及滋养细胞情况；各组小鼠胎盘VEGF、TGF‐β1、HIF‐1α、sflt‐1的蛋白表达量。

1.3 统计学处理采用SPSS13.0统计软件进行分析。所得结果以±s表示，采用单因素方差分析（One‐Way ANOVA），采用Pearson分析进行相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组胚胎丢失率的比较与正常妊娠组比较，模型组胚胎吸收率显著升高（P＜0.05）；连续给药15 d后，与模型组比较，补肾活血方高剂量组、低剂量组、阿司匹林组胚胎吸收率均显著降低（P＜0.05）。见表1。

2.2 各组小鼠胎盘病理形态、螺旋动脉及滋养细胞分析见图1、2，正常妊娠组：胎盘滋养细胞排列整齐，细胞规则，细胞核染色清晰，胞浆丰富，染色淡红，细胞核位于中央。血管形态相对完好，血管数量正常，管壁完整，管壁内未见明显瘀血。模型对照组：与正常妊娠组类似。模型组：细胞排列紊乱，形态不规则，胞浆水肿，绝大部分细胞核消失、坏死、核固缩，细胞空泡样变，组织空泡结构明显，细胞核染不清晰，细胞核固缩，甚至消失。血管内皮细胞损伤，同时可见炎症细胞浸润。血管数量明显减少，血管壁不完整，管壁内见明显瘀血。补肾活血方高剂量组：病理改变有较为明显的减轻，胎盘滋养细胞有一定程度损伤，可见炎症细胞浸润和部分细胞空泡样变，但较模型组减轻。补肾活血方低剂量组：病理改变有较为明显的减轻，胎盘滋养细胞有一定程度损伤，可见炎症细胞浸润和部分细胞空泡样变，但较模型组减轻。阿司匹林组：与模型组比较小鼠胎盘病理形态、螺旋动脉及滋养细胞均有改善。

表1 各组小鼠胚胎吸收率比较（n=6）Tab.1 Comparison of embryo absorption rate of each group（n=6）

图1 各组小鼠胎盘滋养细胞HE染色（×200）Fig.1 HE staining of placental trophoblast of mice in each group（×200）

图2 各组小鼠胎盘螺旋动脉HE染色（×200）Fig.2 HE staining of placental spiral artery of mice in each group（×200）

图3 各组小鼠VEGF、TGF‐β1、HIF‐1α、sflt‐1蛋白表达量灰度图Fig.3 Gray scale of VEGF，TGF‐β1，HIF‐1α and sflt‐1 protein expression in each group

图4 各组妊娠小鼠胎盘组织VEGF、HIF‐1α、TGF-β1、sflt‐1蛋白相对表达量比较Fig.4 Comparison of relative expression of VEGF，HIF‐1α，TGF‐β1，sflt‐1 protein in placenta of pregnant mice in each group

图5 VEGF、TGF‐β1蛋白表达量灰度分析比值相关性分析Fig.5 Correlation Analysis of gray scale analysis ratio of VEGF and TGF‐β1 protein expression

2.3 小鼠胎盘组织中VEGF、TGF‐β1、HⅠF‐1α、sflt‐1的蛋白表达量与正常妊娠组比较，模型组妊娠小鼠VEGF蛋白表达显著降低；与模型组比较，高剂量、低剂量组、阿司匹林组VEGF蛋白表达显著升高；补肾活血方高剂量组VEGF蛋白表达显著高于低剂量组及阿司匹林组。各组小鼠胎盘组织HⅠF‐1α蛋白表达量无显著性差异。与正常妊娠组比较，模型组TGF‐β1蛋白表达显著降低；与模型组比较，补肾活血方高剂量组、低剂量组、阿司匹林组TGF‐β1蛋白表达显著升高。与正常妊娠组比较，模型组妊娠小鼠sflt‐1蛋白表达显著升高；与模型组比较，补肾活血方高剂量组、低剂量组、阿司匹林组sflt‐1蛋白表达显著下降；高剂量组sflt‐1的蛋白表达显著低于低剂量组及阿司匹林组。见图3、4。

2.4 VEGF、TGF‐β1蛋白表达量灰度分析比值相关性分析VEGF、TGF‐β1蛋白表达量灰度分析比值呈明显正相关（R2=0.999 6）。见图5。

3 讨论

RSA在中医中属“滑胎”范畴，先天肾气不足，后天脾胃虚弱、房劳多产、忧思劳倦、跌扑闪挫、情志失宜等是其发病的主要因素。胞宫乃孕育之所，其生理特点为“瘀血不去，新血不生”，胞宫藏泻失调，血瘀阻滞胞宫，胎元失养，故而“屡孕屡堕”。APS致RSA患者，辩证多属血瘀，其病机以肾虚为本，血瘀为标，肾虚血瘀为其主要发病机制，中医辨证以补肾活血多能奏效。目前有关VEGF、HIF‐1、TGF‐β、sflt‐1等血管活性因子对妊娠的影响，尤其是APS与母胎界面的血管活性因子的相关性研究较少。因此，本文针对APS小鼠，研究补肾活血方对母胎界面VEGF、HIF‐1、TGF‐β、sflt‐1蛋白表达的影响，探讨中医药防治RSA的作用机制。

VEGF具有促使血管内皮细胞生长、分化、迁移，修复血管内皮损伤，诱导血管生成，维持血管壁通透性、完整性等作用。妊娠期VEGF主要分布在滋养细胞、血管内皮细胞中，促进滋养细胞的浸润和分化，促使胎盘血管形成，维持血管通透性［10］。VEGF表达不足、血管内皮细胞增殖和迁移能力下降、血管通透性相关活性物质下调，胚胎血管、蜕膜血管、绒毛及胎盘血管生成障碍，导致流产［11］。VEGF在正常妊娠绒毛组织中表达率为100%，在稽留流产等病理妊娠绒毛组织中表达仅70%，RSA与VEGF的异常表达存在相关性［12‐14］。HIF‐1α是血管生成的启动因子，通过诱导血管生成发挥作用［15‐16］。研究表明稽留流产绒毛组织中HIF‐1α表达上升，其蛋白过度表达抑制滋养细胞向侵入型分化，使滋养细胞侵入子宫螺旋动脉变浅，减少胚胎、胎盘血管灌注，胚胎缺血、缺氧导致流产［17‐18］。TGF‐β1主要表达于胎盘绒毛合体滋养细胞，并调节胎盘绒毛合体滋养细胞增殖、分化、浸润。孕期TGF‐β1调控胎盘新生血管形成、血管通透性，促进胎盘绒毛合体滋养细胞增殖［19］。TGF‐β1在RSA患者外周血的表达低于正常妊娠者，低浓度TGF‐β1使母体免疫失衡，炎症反应加剧，破坏胎盘血管形成［20‐21］。sflt‐1由胎盘合体滋养细胞分泌，具有抑制血管内皮细胞有丝分裂，降低血管内皮细胞增殖；破坏血管壁完整性、通透性，抗血管生成等作用［22］。RSA患者血清及绒毛中sflt‐1表达显著高于正常人群［23］。可能与sflt‐1异常升高，加速VEGF灭活，抑制滋养细胞浸润，阻碍蜕膜、胎盘血管形成，引起子宫螺旋小动脉循环障 碍 有 关［24］。研究认为检测外周血sflt‐1对RSA的诊断有一定价值［25］。

有关中药对母胎界面血管活性因子影响的研究较少，大多以补肾健脾益气为治疗原则。有实验研究结果表明补肾健脾中药可上调流产小鼠模型蜕膜中VEGF的表达［26］。临床研究认为补肾中药可上调RSA患者外周血TGF‐β1表达，而补肾活血方可调节RSA患者血清中VEGF、sflt‐1水平，降低流产率，提高活产率［27‐28］。补肾活血方药对APS致RSA外周血及母胎界面的血管活性因子的研究较少见。因此，针对本病肾虚血瘀的发病机制，本研究方药以全国名老中医王自平教授经验方为基础，以补肾活血为主旨，方中菟丝子补肾益精，固摄冲任以阴胎；桑寄生、续断补益肝肾；阿胶滋养阴血安胎。当归养血活血；川芎活血祛瘀、行气开郁；熟地黄补血滋阴、益精填髓。党参补气益、健脾养血；白术健脾益气；补气以推动血行，助当归、川芎祛瘀之效。上药合用则肾精充、脾气旺、祛瘀而不损胎。海螵蛸、藕节炭收敛止血、固摄冲任、清热化瘀，止血而不留瘀滞。白芍缓急止痛，甘草调和诸药。前期临床研究表明：补肾活血方治疗肾虚血瘀型APS致RSA疗效显著，提高中医证候疗效、抗磷脂抗体转阴率及活产率［29］。其作用机制有待进一步深入研究。

针对APS对母胎界面及胚胎的不良影响，补肾活血方药可上调VEGF、TGF‐β1蛋白表达，下调sflt‐1蛋白表达，促进胎盘血管生成，改善胎盘血管通透性，提高血管内皮细胞及胎盘绒毛合体滋养细胞增殖；同时可改善小鼠胎盘组织、螺旋动脉及滋养细胞病理改变。最终达到促进胚胎发育，降低流产率的作用。但其对母胎界面血管生成因子的调节机制及作用环节有待进一步深入探讨。