阿魏酸通过调控JAK2/STAT6免疫信号通路抑制肺癌细胞增殖和转移①

郭风 赵瑞敏 李景亮 刘源溪 杨淑娟（禹州市中医院肿瘤内科，禹州 461670）

目前，肺癌在我国处于高发状态，且发病率逐年上升［1］。作为一个全球医疗领域的研究热点问题，目前针对肺癌的研究已有很多，但对肺癌治疗有效的药物仍然很少［2］。肺癌发生的分子机制十分复杂，致病因素多样，导致其具有较高发病率［3］。国内外对肺癌的药物研发已有很多，但阿魏酸作为传统中药阿魏和川芎的提取物［4］，其对肺癌的作用研究相对较少。目前有研究表明，传统中药阿魏（feru-lic acid，FA）和川芎具有很好的抑癌作用［5］，但是具体的抑癌成分尚不十分清楚，阿魏酸作为阿魏和川芎的提取物在抑癌作用中起到什么作用，同样没有报道。因此本研究以阿魏酸为研究对象，观察其对非小细胞肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭的作用，同时对其作用的分子机制做了初步探讨。

1 材料与方法

1.1 材料A549细胞购自郑州大学细胞库；阿魏酸单体购自河南省食品药品检验所；蛋白定量试剂盒、SDS凝胶试剂盒、细胞裂解液购自北京碧云天；结晶紫、高锰酸钾、草酸、冰醋酸购自郑州马基森生物科技有限公司；蛋白酶抑制剂购自罗氏试剂生物有限公司；DMEM培养液、胎牛血清、胰蛋白酶消化液、青 链 霉 素购 自HyClone；β‐actin/COX‐2、Sur-vivin、XIAP、p‐53抗体购自Abcam。

1.2 方法

1.2.1 CCK‐8增殖实验A549细胞4×105个/孔铺板，细胞密度达到80%左右，不同浓度阿魏酸处理48 h。结束后每孔加入20µl CCK‐8试剂，避光3 h，摇床振荡15 min。酶标仪450 nm检测细胞CCK‐8混合液OD值进行活力分析。

1.2.2 qRT‐PCR A549细胞4×105个/孔直接铺板，细胞密度达到80%左右，给予10 ng/ml TGF‐β1刺激24 h，随后不同浓度阿魏酸给药处理48 h，严格按照试剂盒说明步骤进行提取、定量、反转录和PCR反应。

1.2.3 Western blot A549细胞4×105个/孔直接铺板，细胞密度达到80%左右，10 ng/ml TGF‐β1刺激24 h，20µmol/L姜黄素处理48 h。随后消化细胞铺至培养皿，细胞密度80%时收集细胞，裂解液（含有蛋白酶抑制剂）冰上裂解30 min后，4℃高速离心30 min后吸取上层蛋白。蛋白定量完成后加上样缓冲液，沸水煮5 min。电泳结束后进行转膜，随后脱脂牛奶封闭，PBST清洗Ku70、CDK12和β‐actin一抗（抗体稀释比均为1∶1 000），4℃过夜。第2天冷PBS清洗条带3次，二抗孵育1 h，发光仪发光拍照。

1.2.4 ELⅠSA检测免疫炎症因子水平A549细胞4×105个/孔直接铺板，细胞密度达到80%左右，给予不同浓度阿魏酸处理48 h。采集细胞培养液，3 000 r/min离心20 min，离心分离后取上清液进行检测。严格按照ELISA试剂盒说明书步骤，检测细胞培养液IL‐4、PDGF和GM‐CSF的含量。

1.2.5 细胞划痕实验A549细胞4×105个/孔铺板，细胞密度达到80%左右，划痕处理，显微镜下观察拍照，给予不同浓度阿魏酸处理48 h，显微镜下观察拍照。

1.2.6 细胞侵袭实验A549细胞4×105个/孔铺板，细胞密度达到80%左右，Transwell小室上室无血清DMEM接种A549细胞，下室10%血清DMEM。给予不同浓度阿魏酸处理48 h。多聚甲醛固定10 min，结晶紫室温染色15 min，33%乙酸脱色。酶标仪570 nm检测混合液OD值并进行分析。

1.3 统计学分析所有数据均经SPSS20.0软件统计分析，计量资料以±s表示，组间比较用t检验，多组间比较用F检验，P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度阿魏酸对A549细胞增殖的抑制作用CCK‐8检测不同浓度阿魏酸（0、0.5、1、2、4、8、16 mg/ml）给药处理后的A549细胞活力，结果显示不同浓度阿魏酸对A549的增殖具有抑制作用，且呈剂量依赖性，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

2.2 阿魏酸抑制A549细胞迁移能力2、4、8 mg/ml阿魏酸给药处理A549细胞，48 h后观察A549细胞划痕愈合情况。结果表明，2、4、8 mg/ml阿魏酸作用A549细胞48 h后均能显著抑制A549细胞划痕愈合能力，且呈剂量依赖性，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

2.3 阿魏酸抑制A549细胞侵袭能力2、4、8 mg/ml阿魏酸给药处理A549细胞，48 h后观察A549细胞侵袭情况。结果表明2、4、8 mg/ml阿魏酸作用A549细胞48 h后均能显著抑制A549细胞侵袭，且呈剂量依赖性，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

图1 不同浓度阿魏酸对A549细胞增殖抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of ferulic acid at different concen-trations on A549 cell proliferation

图2 不同浓度阿魏酸对A549细胞迁移抑制作用Fig.2 Different concentrations of ferulic acid on migra-tion inhibition of A549 cells

图3 不同浓度阿魏酸对A549细胞侵袭抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of ferulic acid at different concen-trations on A549 cell invasion

图4 不同浓度阿魏酸抑制A549细胞肿瘤相关免疫表达Fig.4 Different concentrations of ferulic acid inhibit tu-mor‐associated immune expression in A549 cells

图5 阿魏酸抑制A549细胞JAK2/STAT6免疫信号通路激活Fig.5 Ferulic acid inhibitis activation of JAK2/STA6 im-mune sigaling pathway in A549 cells

2.4 阿魏酸抑制A549细胞肿瘤相关免疫因子表达2、4、8 mg/ml阿魏酸给药处理A549细胞，48 h后观察A549细胞培养液中肿瘤相关免疫因子IL‐PDGF和GM‐CSF的表达情况。结果表明2、4、8 mg/ml阿魏酸作用A549细胞48 h后均能显著抑制A549细胞培养液中肿瘤相关免疫因子IL‐4、PDGF和GM‐CSF的表达，且呈剂量依赖性，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图4。

2.5 阿魏酸抑制A549细胞JAK2/STAT6免疫信号通路激活2、4、8 mg/ml阿魏酸给药处理A549细胞，48 h后观察A549细胞JAK2和STAT6的磷酸化以及p53、COX‐2、Survivin和XIAP的表达变化。结果表明2、4、8 mg/ml阿魏酸均能抑制JAK2和STAT6的磷酸化，上调p53的mRNA和蛋白表达，下调COX‐2、Survivin和XIAP的mRNA和蛋白表达，且呈剂量依赖性，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图5。

3 讨论

肺癌已经成为影响人类健康的主要肿瘤疾病之一［1］。因其恶性程度高，发病的隐匿性以及难治愈性，已经成为肿瘤治疗领域的研究热点和临床迫切需要解决的问题［6］。免疫信号通路的激活是肺癌细胞抗凋亡和发生肿瘤逃逸的主要原因［7‐8］，因此针对免疫信号的研究为非小细胞肺癌的治疗提供新的思路和策略。

顺铂和紫衫醇在非小细胞肺癌的药物治疗中运用较成熟，但是其有较强的副作用，对患者术后恢复和生活造成严重影响［9］。阿魏酸来源于伞形科植物阿魏和川芎的根茎，具有抗血小板聚集、抑制血小板5‐羟色胺释放、抑制血小板血栓素A2（TXA2）的生成、增强前列腺素活性、镇痛、缓解血管痉挛等作用［10］。近些年有少量研究指出阿魏酸具有一定的抗肿瘤作用［11］，但没有具体深入的机制研究，特别是涉及肿瘤免疫信号通路。因此本研究主要探讨阿魏酸在体外对非小细胞肺癌增殖、迁移和侵袭的作用及其可能的作用机制。

肿瘤细胞的快速和无限增殖是肿瘤恶化的基础，本研究首先观察不同浓度阿魏酸对非小细胞肺癌A549细胞增殖的作用，结果发现阿魏酸能够有效抑制A549细胞体外增殖，并且呈剂量依赖性。为了进一步观察在其他实验中阿魏酸是否同样呈现剂量依赖性，后续实验中选择2、4、8 mg/ml 3个浓度作为给药浓度。迁移和侵袭实验是模拟验证肿瘤细胞在体内的转移能力，这为研究阿魏酸在体内对非小肺癌细胞的转移作用奠定体外研究基础。有研究证明JAK2/STAT6在多种肿瘤逃逸过程中扮演重要角色，作为一条经典的肿瘤免疫信号通路，JAK2/STAT6可以通过磷酸化激活下游COX‐2、Survivin和XIAP的表达，且抑制P53的表达［12］。本研究用不同浓度阿魏酸给药处理A549细胞后，发现阿魏酸可以有效抑制JAK2/STAT6的磷酸化，同时观察到下游的促癌基因COX‐2、Survivin和XIAP随着阿魏酸浓度的增高而表达降低，P53表达则与之相反，说明阿魏酸可以有效抑制JAK2/STAT6肿瘤免疫信号通路的激活。

综上所述，体外细胞实验均证实阿魏酸可以抑制A549细胞的增殖、迁移和侵袭，而这些抑制作用很可能是通过抑制肿瘤免疫信号通路JAK2/STAT6的激活来实现的。但是阿魏酸在体内是否可以发挥同样的作用，这是下一步的研究内容。