基于能量代谢系统评价延胡索乙素对人肝癌细胞的影响①

尹逊哲 刘作家 郭焱（长春中医药大学，长春 130117）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原发性肝癌的主要类型。HCC已成为全球第六大常见癌症和第四大癌症死亡原因，世界卫生组织预计到2030年，全球将有超过一百万人因HCC死亡［1］。虽然目前临床的化疗、放疗等治疗方法对HCC患者的治疗效果显著，但患者的5年生存率仅在14.1%左右［2］。由于HCC死亡率高、预后差，开发更有效的治疗策略和药物是当务之急。延胡索乙素（tetra-hydropalmatine，THP）又称四氢巴马汀，是罂粟科紫堇属植物延胡索的一种生物碱（属于原小檗碱类生物碱），是中药材延胡索的主要有效成分，目前广泛应用于医学和药理学［3‐4］。线粒体是机体能量代谢、物质合成及信号转导的细胞器，为多数真核细胞提供氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）产生的ATP［5］。与正常细胞主要依赖于OXPHOS不同，肿瘤细胞增殖不仅需要重要介质——线粒体，还依赖有氧糖酵解，糖酵解的增加为肿瘤细胞快速增殖提供“合成材料”［6］。因此，了解肿瘤发生过程中药物治疗线粒体的机制将是下一代癌症治疗的关键。目前，延胡索乙素对人HCC SMMC‐7721细胞的能量代谢作用尚未阐明。本实验通过THP调控SMMC‐7721细胞能量代谢影响OXPHOS和糖酵解的能量代谢表型，实现THP对肿瘤细胞增殖的抑制作用，以期为HCC的治疗与基础研究提供新策略。

1 材料与方法

1.1 材料延胡索乙素购自北京索莱宝生物公司；人HCC细胞株SMMC‐7721购自中国科学院上海细胞库；RPMI1640培养液、胎牛血清购自美国Gibco公司；CCK‐8细胞活力试剂盒购自日本同仁公司；Seahorse XFp体外细胞能量代谢分析系统、细胞线粒体压力测试试剂盒、糖酵解压力测试试剂盒、Cali-brant校准液、细胞微孔培养板及探针板购自美国Agilent公 司；FITC偶 联Annexin‐V凋 亡 试 剂 盒、PI/RNase染色溶液购自美国BD公司；抗caspase‐3抗体、抗caspase‐9抗体和抗cytochromec抗体购自英国Abcam公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗鼠IgG抗体购自北京中杉金桥生物技术公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 CCK‐8法检测THP对SMMC‐7721细胞增殖的影响将处于对数生长期的人HCC细胞SMMC‐7721以5×103个/孔培养于96孔板（100µl/孔），于37℃、5%CO2培养箱中培养过夜，然后分别以0、50、100、150、200、250、300µg/ml THP作用SMMC‐7721细胞，每组设置3个复孔，对照组采用DMSO处理（终浓度0.1%），同法处理以下对照组细胞。37℃、5%CO2培养箱中分别培养24、48和72 h，作用时间到达后，每孔加入10µl CCK‐8溶液，37℃、5%CO2培养箱避光孵育30 min。酶标仪检测450 nm波长下吸光度（OD），按照公式计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率（%）=（OD对照孔-OD药物孔）/OD对照孔×100%。

1.2.2 Seahorse法检测THP对SMMC‐7721细胞能量代谢的影响选择处于对数生长期的SMMC‐7721细胞制备细胞悬液，10% RPMI1640培养基将细胞稀释至5×103个/孔，以5×103个/孔向细胞微孔培养板中加入细胞稀释液50 µl，置于37℃、5%CO2培养箱中培养12～24 h；THP作用SMMC‐7721细胞24 h，进行线粒体有氧呼吸压力测试实验：将2.5 mol/L葡糖糖、0.2 mol/L谷氨酰胺、0.1 mol/L丙酮酸钠加入不含血清和碳酸氢盐的细胞培养基，调整pH，代谢调节药物配置为1 µmol/L寡霉素、1 µmol/L FCCP和0.5 µmol/L鱼藤酮，寡霉素添加至第1个药物注射槽，FCCP加入第2个药物注射槽，鱼藤酮加入第3个药物注射槽，选择线粒体呼吸程序分析；糖酵解压力测试实验：将10 mmol/L葡糖糖加入至不含血清和碳酸氢盐的细胞培养基，调整pH，代谢调节药物配置为寡霉素10 µmol/L、2‐DG 50 mmol/L，寡霉素添加至第1个药物注射槽，2‐DG加入第2个药物注射槽，选择糖酵解程序分析。

1.2.3 流式细胞术检测THP对人HCC SMMC‐7721细胞凋亡的影响制备SMMC‐7721单层细胞悬液，培养于6孔板，细胞密度为2×105个/孔，于37℃、5% CO2培养箱中培养过夜，以THP（150 µg/ml）作用SMMC‐7721细胞24 h。FITC偶联Annexin‐V凋亡试剂盒染色SMMC‐7721细胞，细胞通过C6流式细胞仪上样检测，分析细胞凋亡率。

1.2.4 流式细胞术检测THP对人HCC SMMC‐7721细胞周期的影响于6孔板制备单层SMMC‐7721细胞（2×105个/孔），37℃、5% CO2培养箱中培养12～24 h，THP（150 µg/ml）作 用SMMC‐7721细 胞24 h。到达作用时间后，将细胞悬液收集至15 ml离心管，PBS清洗细胞、离心、弃上清；逐滴加入预冷的乙醇，旋涡振荡细胞，4℃避光过夜；取出后离心、弃上清，PBS清洗后，PI/RNase染色液重悬细胞，转移至流式管，上机检测细胞周期情况。

1.2.5 Western blot检 测THP作用SMMC‐7721细胞后凋亡相关蛋白表达水平制备SMMC‐7721单层细胞培养至6孔板，细胞密度为2×105个/孔，于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，THP（150µg/ml）作用SMMC‐7721细胞24 h。到达作用时间后，收集细胞，提取细胞蛋白质，BCA法测定蛋白质浓度并定量。每孔加20～30 µg蛋白样品，行SDS‐PAGE电泳，电转至PVDF膜，5%脱脂乳室温封闭，一抗孵育过夜。TBST充分洗膜后，室温下结合山羊抗鼠IgG，TBST充分洗膜、曝光、显影。ImageJ软件进行灰度值分析，计算蛋白相对表达量。

1.3 统计学处理采用GraphPad Prism 7.04统计软件，计量数据以±s表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 THP抑制SMMC‐7721细胞增殖CCK‐8检测结果表明，THP呈剂量依赖性抑制SMMC‐7721细胞增殖（图1）；随着作用时间延长，THP（150µg/ml）对SMMC‐7721细胞的抑制率明显增加，且具有时间效应关系（图2）。THP（150 µg/ml）对SMMC‐7721细胞的抑制率在72 h达到（43.30±3.96）%。提示THP可抑制SMMC‐7721细胞增殖。

图1 THP对人HCC细胞SMMC‐7721活性的影响Fig.1 Effect of activity of human HCC SMMC‐7721 cells treatment with THP

图2 THP对SMMC‐7721细胞的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of THP on SMMC‐7721 cells

2.2 THP抑制SMMC‐7721细胞的线粒体呼吸和糖酵解在SMMC‐7721细胞中，与对照组相比，THP（150 µg/ml）作用24 h后线粒体基础呼吸［（54.62±5.03）vs（77.47±6.18）pmoles/min，P＜0.05］、ATP产量［（41.82±2.04）vs（61.16±3.74）pmoles/min，P＜0.05］和 最 大 呼 吸［（100.07±8.47）vs（132.00±16.77）pmoles/min，P＜0.01］显著均降低（图3、4），表明THP参与调控线粒体能量代谢，并降低细胞OX-PHOS水平。Seahorse XFp检测结果表明，与对照组相 比，THP抑 制SMMC‐7721细 胞 的 糖 酵 解 水 平［（26.90±4.98）vs（37.13±2.14）pmoles/min，P＜0.05］、糖酵解能力［（75.93±1.34）vs（85.94±5.45）pmoles/min，P＜0.05］和糖酵解潜能［（43.30±4.46）vs（54.85±1.21）pmoles/min，P＜0.05］，损害SMMC‐7721细胞的有氧糖酵解途径（图5、6）。

图3 THP对SMMC‐7721细胞线粒体呼吸的影响Fig.3 Effects of THP on mitochondrial respiration in SMMC‐7721 cells

图4 THP对SMMC‐7721细胞基础呼吸、ATP产量和最大呼吸的影响Fig.4 Effects of THP on basal respiration，ATP produc-tion and maximal respiration in SMMC‐7721 cells

图5 THP对SMMC‐7721细胞糖酵解的影响Fig.5 Effects of THP on glycolysis in SMMC‐7721 cells

图6 THP对SMMC‐7721细胞糖酵解水平、糖酵解能力和糖酵解潜能的影响Fig.6 Effects of THP on glycolysis，glycolysis capacity and glycolysis reserve in SMMC‐7721 cells

图7 THP对SMMC‐7721细胞凋亡的影响Fig.7 Effects of THP on apoptosis of SMMC‐7721 cells

图8 THP对SMMC‐7721细胞周期G1期的影响Fig.8 Effect of ATV on G1 phase of SMMC‐7721 cells

图9 THP对SMMC‐7721细胞caspase‐3、caspase‐9和cy-tochrome c蛋白表达的影响Fig.9 Effect of THP on expressions of caspase‐3，cas-pase‐9 and cytochrome c protein in SMMC‐7721 cells

2.3 THP诱导SMMC‐7721细胞凋亡并阻滞细胞周期Annexin V‐FITC染色FCM检测结果显示，与对照组相比，THP（150 µg/ml）作用SMMC‐7721细胞24 h后可够诱导HCC细胞SMMC‐7721凋亡，凋亡率为（25.8±2.8）%（图7）；PI/RNase流式细胞术结果显示，G1期细胞逐渐增多，G1期延长（59.02±2.5）%，显著高于对照组，提示THP可阻滞SMMC‐7721细胞G1期，延缓完整的细胞周期，THP引发的凋亡参与细胞周期阻滞反应，进而影响SMMC‐7721细胞增殖（图8）。

2.4 THP介导SMMC‐7721细胞线粒体途径凋亡Western blot检测结果显示，与对照组相比，THP（150 µg/ml）作用SMMC‐7721细胞24 h后caspase‐3、caspase‐9和cytochromec表达量均增加。提示THP可诱导SMMC‐7721细胞凋亡，并介导线粒体途径相关的细胞凋亡（图9）。

3 讨论

在我国癌谱构成中，HCC是我国常见的恶性肿瘤之一，发病率位居第4，死亡率位居2，且呈上升趋势。国际癌症研究最新发布的数据显示，中国HCC的发病及死亡数约占全球HCC总数的50%［7‐8］。尽管目前治疗取得了进展，但HCC仍然是最恶性的疾病之一。THP是中药延胡索的主要有效成分之一，属于异喹啉类化合物，具有多种生物学活性，如镇静、催眠、抗焦虑、镇痛、抗心律失常、抗溃疡、抗心肌缺血及抗肿瘤等功效［9］。目前，THP对人HCC细胞SMMC‐7721抑制增殖作用的研究鲜有报道。因此，本研究以THP作用人肝癌细胞SMMC‐7721，探讨其对SMMC‐7721细胞抗增殖左右的影响及机制。结果表明，在细胞生物活性方面，药物作用时间一定条件下，随着药物剂量增加，THP对SMMC‐7721细胞抑制率有不同程度地提高，具有剂量效应关系（P＜0.01）；在药物剂量一定条件下，随着作用时间延长，THP对SMMC‐7721细胞抑制率显著升高，具有时间效应关系（P＜0.01）。

癌症通过改变新陈代谢、肿瘤细胞重编程营养物质获取和代谢途径满足肿瘤细胞的生物合成和氧化还原需求，使肿瘤细胞无限制地增殖成为可能。干预及紊乱肿瘤细胞代谢途径成为目前抑制肿瘤细胞增殖的新思路。线粒体在细胞中的主要功能是通过产生ATP为细胞代谢和生物合成提供能量，对正常细胞和肿瘤细胞的存活至关重要［10‐11］。科研组采用目前较先进的细胞能量代谢测定手段Seahorse XFp体外能量分析仪，通过免标记固态传感器同时测量细胞两条主要的能量代谢通路，即线粒体呼吸和糖酵解。线粒体依赖有氧进行OXPHOS产生ATP，OCR代表线粒体呼吸作用，因此通过检测细胞的OCR来评估细胞线粒体呼吸；肿瘤细胞在不依赖于氧气通过糖酵解产生ATP，并同时产生乳酸和质子，通过检测（extracellular acidification rate，ECAR）观察糖酵解水平［12］。本研究采用细胞外能量分析系统测量细胞内线粒体呼吸活性，通过氧气消耗率可展现基础呼吸、ATP产量及最大呼吸量，最终反映OXPHOS水平。研究表明，THP导致线粒体功能破坏，减少OXPHOS水平，进而阻断肿瘤细胞增殖所需能量；Seahorse测定了SMMC‐7721细胞的ECAR，表明THP可诱导SMMC‐7721细胞抗有氧糖酵解效应，THP通过降低SMMC‐7721细胞糖酵解功能阻断肿瘤细胞第二种供能方式——有氧糖酵解。

多数抗肿瘤化合物可能具有复杂的机制，但诱导及调控凋亡的信号通路是最关键的。近年报道指出THP可诱导人胃癌细胞、人鼻咽癌细胞凋亡并阻滞细胞周期［13‐15］。本研究流式细胞术结果表明，THP不仅可以诱导SMMC‐7721细胞凋亡，同时还阻滞SMMC‐7721细胞周期，延长G1期，延缓完整的细胞周期进程，印证并完善了THP在抗肿瘤方面的作用。线粒体膜受损可改变线粒体通透性，使△Ψm下降，导致线粒体基质肿胀，释放促凋亡因子cyto-chromec。cytochromec与caspase‐9结合形成凋亡小体，进而激活凋亡的关键执行者caspase‐3，最终导致细胞凋亡［16‐17］。研究发现，caspase作为机体内不活跃的形式酶，在肿瘤细胞面临氧化应激时，触发caspase级联反应，将cytochromec从线粒体释放到胞质，介导线粒体途径的细胞凋亡。

综上，本研究首次证明THP可抑制线粒体OX-PHOS和糖酵解产生，诱导过度氧化应激，从而导致线粒体功能紊乱，这是介导SMMC‐7721细胞线粒体凋亡途径的潜在机制。以上特点可为肿瘤治疗提供新思路和新方式，同时也表明THP具有开发为临床治疗肝癌药物的潜力。