淫羊藿总黄酮通过抑制小胶质细胞/巨噬细胞介导的氧化应激反应促进髓鞘再生①

韩庆贤 丁智斌李晓慧 宋丽娟王青 柴智 尉杰忠 马存根

（山西中医药大学国家中医药管理局多发性硬化益气活血重点研究室/神经生物学研究中心，太原 030024）

研究表明，氧化应激（oxidative stress，OS）反应参与神经损伤过程，既是其发病机制的关键特征，也是重要的病理变化［1］。淫羊藿总黄酮（total flavo-noids of herba epimedii，TFE）是淫羊藿的主要黄酮醇类化合物，具有调节神经内分泌、提高免疫力、抗炎与抗氧化等作用［2］。TFE已被证实是一种有效的抗氧化剂［3］。中枢神经系统（central nervous system，CNS）炎症性脱髓鞘病是一种累及脑、脊髓和周围神经的自身免疫性疾病，主要包括多发性硬化症（mul-tiple sclerosis，MS）、视神经脊髓炎（neuromyelitis op-tica，NMO）和急性播散性脑脊髓炎（acute dissemi-nated encephalomyelitis，ADEM）等，但病因及发病机制尚未阐明，临床尚无有效治疗方式［4］。目前研究认为，OS是其主要发病机制之一［5］。OS可产生过多的氧自由基及其他代谢产物，引发细胞脂质、蛋白和线粒体损伤，甚至诱导细胞死亡导致髓鞘脱失，从而导致脱髓鞘症状［6］。核因子E2相关因子2/血红素加氧酶‐1（nuclear factor erythroid‐2‐related fac-tor 2/heme oxygenase 1，Nrf2/HO‐1）信号通路可抵抗OS损伤，是机体重要的内源性抗氧化体系之一［7］。

双环己酮草酸二腙（cuprizone，CPZ）可选择性损伤少突胶质细胞（oligodendrocytes，OLs），在CNS多个区域诱导脱髓鞘，并伴随小胶质细胞活化。因此，CPZ脱髓鞘模型是研究和开发靶向髓鞘保护与再生药物的理想动物模型［8］。本研究通过体外与体内研究探讨TFE对小胶质细胞/巨噬细胞OS的抑制作用，以及能否通过抑制OS缓解脱髓鞘，促进髓鞘再生。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与动物BV2细胞株传自本实验室；18只成年C57BL/6雄性小鼠（10～12周龄）由北京维通利华实验动物有限公司提供，实验开始前于山西中医药大学清洁级动物实验室适应性喂养1周。

1.1.2 试剂与仪器含0.2%CPZ的饲料（美国Sig-ma‐Aldrich公司）；DPPH（德国Sigma‐Aldrich公司）；各检测试剂盒（南京建城生物工程公司）；anti‐Iba‐1、anti‐Nrf2、anti‐HO‐1（美国Abcam）；anti‐CNPs（德国Millipore）；激光共聚焦显微镜（日本奥林巴斯）。

1.2 方法

1.2.1 原代小胶质细胞制备取新生C57BL/6小鼠（72 h内），75%乙醇消毒，无菌条件下断头，剪开头皮及颅骨，取脑组织，高糖DMEM基础培养基中（下置冰袋）培养；无菌剥离脑组织，除去小脑、海马、大脑髓质，分离大脑皮层，剥离脑膜及血管；剪成1～3 mm组织块，10 000 r/min离心10 min，离心3次，将细胞铺于75 cm2培养瓶，5% CO2、37℃培养14～16 d，摇床上轻摇6 h，脱离小胶质细胞，1 500 r/min离心10 min，获取原代小胶质细胞，接种于24孔板，5%CO2、37℃培养。

1.2.2 骨髓来源巨噬细胞（bone marrow‐derived macrophages，BMDMs）制备取成熟C57BL/6小鼠处死，75%乙醇消毒，超净台内取其股骨骨髓内细胞1 500 r/min离心7 min，红细胞裂解液裂解，培养液重悬，均匀接种于10 cm培养皿，加入100 ng/ml M‐CSF诱导骨髓细胞向单核巨噬细胞分化，5%CO2、37℃培养7 d。

1.2.3 分组与给药BV2细胞、小胶质细胞及BM-DMs随机分为正常对照组、LPS组及LPS+TFE组。TFE（15 µg/ml）预处理2 h后给予LPS（1 µg/ml）刺激24 h。18只小鼠按平均体重随机分为正常组、模型组及TFE治疗组，每组6只。模型组和TFE治疗组用含0.2%CPZ的饲料喂养6周诱导脱髓鞘模型，正常组给予正常饲料，每天记录体重和食物消耗。造模第4周末（第28天）TFE治疗组小鼠腹腔注射TFE 50 mg/（kg·d），200 µl/只，直到第6周末，正常组和模型组每天给予等量生理盐水。

1.2.4 组织制备10%水合氯醛麻醉小鼠，生理盐水经心脏灌注，4%多聚甲醛固定，提取脑组织，脱水，OCT包埋，低温切片机切片，用于免疫荧光染色。

1.2.5 DPPH、ABTS和FRAP法检测自由基清除能力DPPH实验：通过光谱光度计对DPPH的紫色甲醇溶液进行漂白，确定其抗氧化活性。将30µl不同浓度的TFE溶液加入到270 µl DPPH溶液中（乙醇中最终浓度为0.2 mmol/L），室温孵育30 min，检测515 nm处吸光度，计算DPPH清除效果（%）=（1-A抗氧化物质与DPPH反应/A溶剂DPPH）×100%。各样品独立重复实验3次。ABTS实验：7 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L过硫酸钾溶于10 ml无水乙醇，室温避光12 h，制备ABTS溶液。将30 µl不同浓度的TFE溶液加入至270 µl ABTS无水乙醇溶液中，室温孵育30 min，检测734 nm处吸光度，计算ABTS清除效应（%）=（A溶剂ABTS-A抗氧化物质与ABTS反应）/A溶剂ABTS×100%，各样品独立重复实验3次。FRAP实验：乙酸缓冲液（0.1 mol/L，pH 3.6）、TPTZ（10 mmol/L）和三氯化铁（20 mmol/L）制备FRAP试剂，室温避光孵育8 min。将30 µl不同浓度的TFE溶液加入到270 µl FRAP溶液中，室温孵育30 min，检测593 nm处吸光度，计算FRAP清除效果（%）=（A溶剂FRAP-A抗氧化物质与FRAP反应）/A溶剂的FRAP×100%，各样品独立重复实验3次。

1.2.6 氧化和抗氧化指标检测3 000 r/min离心细胞悬液10 min，取上清。3 000 r/min离心组织匀浆10 min，BCA法定量提取蛋白。按照试剂盒说明书检测抗氧化指标［如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH‐Px）和过氧化氢酶（CAT）水平］及氧化中间产物［如丙二醛（MDA）、过氧化氢（H2O2）和一氧化氮（NO）水平］。

1.2.7 免疫荧光染色脑组织切片（10 µm）在室温中用4%多聚甲醛固定30 min，加入anti‐Iba‐1、anti‐Nrf2、anti‐HO‐1、anti‐CNPs，4℃孵 育 过 夜，PBS洗涤，加入相应二抗室温1 h，50%甘油封片，激光共聚焦收集图像，Image‐ProPlus6.0软件分析结果。

1.2.8 Black GoldⅡ染色4%多聚甲醛固定切片15 min，烘干，ddH2O浸润2 min，置于泡沫板60℃水浴加热，滴加提前预热的Black GoldⅡ染液染色20 min，ddH2O冲洗2次，滴加预热好的硫代硫酸钠溶液，60℃水浴孵育10 min，ddH2O浸洗2次，滴加结晶紫室温染色3 min，ddH2O浸洗。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察。

1.3 统计学分析采用GraphPad 8.0软件进行统计学分析，数据以±s表示，多组间比较采用方差分析（ANOVA），两两比较采用配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TFE剂量依赖性清除自由基TFE的DPPH自由基清除活性从10.76%上升为76.45%，TFE浓度为1.56～100µg/ml，DPPH的IC50为24.01µg/ml。1.56～100 µg/ml TFE的FRAP自由基清除活性从11.12%上升为66.17%，FRAP的IC50为35.47µg/ml。ABTS自由基清除活性在16.24%～66.82%存在差异，TFE浓度变化范围为1.56～100µg/ml，ABTS的IC50为30.08 µg/ml。TFE可 清 除DPPH、ABTS和FRAP自由基，且呈剂量依赖性（图1）。

2.2 TFE对BV2小胶质细胞、原代小胶质细胞、BMDMs OS的影响如图2所示，与LPS刺激组相比，TFE显著降低BV2小胶质细胞NO、H2O2水平（P＜0.05），显著降低原代小胶质细胞NO、H2O2和MDA水平（P＜0.05），上调BV2小胶质细胞、原代小胶质细胞抗氧化酶SOD、CAT和GSH‐Px水平（P＜0.05），BMD-Ms结果与BV2细胞和原代小胶质细胞结果相似。

图1 TFE剂量依赖性地清除自由基Fig.1 TFE scavenged free radicals in a dose‐dependent manner

2.3 TFE抑制CPZ脱髓鞘模型OS与体外实验一致，同CPZ喂养的小鼠相比，TFE处理可显著降低脱髓鞘小鼠脑蛋白中氧化产物NO、H2O2和MDA含量，上调SOD、CAT和GSH‐Px抗氧化产物含量（P＜0.05，图3）。

2.4 TFE激活Nrf2/HO‐1抗氧化通路Nrf2是一种重要的内源性抗氧化途径，能增加下游抗氧化酶Ⅱ相酶中的HO‐1表达。Nrf2/HO‐1信号通路在CNS氧化应激中发挥重要作用［9］。为验证TFE的抗氧化作用是否与Nrf2/HO‐1信号通路有关，用免疫荧光法检测体外小胶质细胞与脑内Nrf2/HO‐1表达，结果表明，与正常组相比，LPS模型组与CPZ模型组喂Nrf2和HO‐1表达（P＜0.01，图4），而TFE治疗后则显著增加其表达（分别为P＜0.01，P＜0.001，图4）。结果表明，TFE可能通过诱导Nrf2/HO‐1信号通路抑制OS。

图2 TFE对BV2小胶质细胞、原代小胶质细胞、BMDMs OS的影响Fig.2 Effect of TFE on OS of BV2 microglia cells，prima-ry microglia cells and BMDMs

图3 TFE对CPZ脱髓鞘小鼠OS的影响Fig.3 Effect of TFE on OS in CPZ demyelinating mice

图4 TFE激活Nrf2/HO‐1抗氧化通路Fig.4 TFE activates Nrf2/HO‐1 antioxidant pathways

图5 TFE减少胼胝体髓鞘脱失Fig.5 TFE reduces myelin loss in corpus callosum

图6 TFE促进髓鞘再生Fig.6 TFE promotes myelin regeneration

2.5 TFE缓解胼胝体髓鞘脱失、促进髓鞘再生Black GoldⅡ染色显示，CPZ模型组小鼠胼胝体部位髓鞘脱失明显（P＜0.01），TFE治疗后，胼胝体部位髓鞘脱失明显改善（P＜0.01，图5）。免疫荧光染色结果显示，与正常小鼠相比，CPZ模型组小鼠脑内胼胝体区CNPase+细胞减少（P＜0.001），TFE干预组明显增多（P＜0.001，图6）。提示TFE治疗可促进CPZ脱髓鞘小鼠少突胶质细胞分化，促进髓鞘形成与修复。

3 讨论

Nrf‐2/HO‐1是细胞内主要的抗氧化通路，CNPase是髓鞘形成相关蛋白，可特异性表达OLs［9‐10］。研究表明，氧化损伤与CNS变性疾病的发病机制相关［11］。LPS可诱导活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成，导致氧化/抗氧化失衡和OS，从而导致细胞组织损伤［12］。CNPase+细胞减少提示OLs成熟或髓鞘再生障碍，而CNPase+细胞增多则提示OLs分化与髓鞘形成。本研究首先建立了体外DPPH、ABTS和FRAP测定TFE的氧化活性实验，结果表明，TFE具有较强的清除DPPH、ABTS和FRAP自由基的能力，且在一定范围内与其浓度呈正相关。

氧化还原敏感转录因子Nrf2在氧化条件下与抑制因子Kelch样ECH联合蛋白1分离，并与抗氧化反应元件Pr结合被激活，启动下游抗氧化基因HO‐1转录［13］。研究发现，Nrf‐2和HO‐1在CNS变性疾病中表达降低，而在治疗后表达升高，并减轻局部OS［14‐16］。说明Nrf2在OS相关的神经变性疾病中起重要保护作用。本研究发现体外LPS诱导的小胶质细胞/巨噬细胞中氧化标记物NO、H2O2、MDA水平上升，而TFE干预组NO、H2O2、MDA表达降低，抗氧化酶SOD、CAT、GSH‐Px表达上升，并激活Nrf2，提高HO‐1表达，且在CPZ诱导的脱髓鞘小鼠模型中得到了验证。结果表明，TFE干预组中，Nrf2和HO‐1有显著的调节作用，支持了TFE具有抗氧化作用的假设。

本研究表明，TFE可抑制小胶质细胞/巨噬细胞介导的OS，减少髓鞘脱失，促进髓鞘再生，可能通过激活抗氧化通路Nrf2/HO‐1发挥作用。