液相色谱-高分辨串联质谱法检测牛奶中A1和A2 β-酪蛋白

刘泽阳, 李 明, 吴佩泽, 宁 杨, 梁大鹏

(1．吉林大学 地下水资源与环境教育部重点实验室, 新能源与环境学院, 长春 130012; 2. 中国计量科学研究院 化学计量与分析科学研究所, 北京 100029)

酪蛋白约占牛奶中蛋白含量的80%[1], 酪蛋白主要包括α，β和κ-酪蛋白, 其中β-酪蛋白约占40%[2]. 目前已发现超过10种β-酪蛋白的变体形式， 其中最主要的两种是A1和A2β-酪蛋白(简称A1和A2蛋白)[3]. A1和A2蛋白唯一区别在于其一级结构的第67位氨基酸, A1蛋白为组氨酸(Histidine, H), A2蛋白为脯氨酸(Proline, P)[4]. 尽管两种酪蛋白的差别微小, 但在人体内消化时会产生不同的生物活性肽[5]. A1蛋白产生的β-酪啡肽-7(BCM-7)可诱发多种疾病[6]， 而A2蛋白则不产生BCM-7[7]. 研究表明, 经常摄入A1蛋白的人群在Ⅰ型糖尿病[8]、 胃肠感染[9]和缺血性心脏病[10]中的发病率高于摄入A2蛋白的群体. 文献[11]研究表明， 患自闭症儿童尿液中的BCM-7含量明显高于健康儿童, 且其BCM-7的浓度与病情严重程度正相关. 尽管关于BCM-7的危害尚存在争论[12], 但摄入不同酪蛋白引起的不同结果已得到广泛关注. 为区分酪蛋白, 本文将仅含有A2蛋白的牛奶标为“A2牛奶”, 以此为消费者提供针对性选择. 因此, 开发一种区分牛奶中A1和A2蛋白的检测方法具有重要意义.

检测牛奶及乳制品中β-酪蛋白种类的方法较多, 如通过电泳法结合多元线性回归(MLR)可初步判断奶酪中的酪蛋白种类[13]， 尿素-聚丙烯酰胺电泳可区分牛奶中的A1和A2蛋白[14], 也可通过中红外光谱法[15]或聚合酶链式反应[16]对牛奶中的蛋白质进行分析, 确定蛋白质的组成和含量. 近年来, 色谱和质谱技术的快速发展为各领域提供了高灵敏度、 高精度和高可靠性的检测方法. 液相色谱可分离牛奶中不同的酪蛋白, 高分辨质谱在检测完整蛋白质方面具有非常高的可靠性和灵敏度[17]. 但是不同酪蛋白间的差异很小, 它们通常具有相似的物理、 化学性质, 增大了液相色谱的分离难度. 因此, 通过对酪蛋白酶解产生的特征肽段确定β-酪蛋白种类是一种更可行的方法[18].

本文建立一种基于液相色谱-高分辨串联质谱(LC-HRMS/MS)的检测方法, 通过检测特征肽段区分牛奶中的A1和A2蛋白. 先用等电点沉淀法提取牛奶中的酪蛋白, 经胰蛋白酶酶解后, 再采用LC-HRMS/MS对酶解产物进行分析. 考虑到A1和A2蛋白差异点在第67位氨基酸, 所以选择酶解后的蛋白片段49～97作为特征肽段. 除色谱保留时间和一级质谱质荷比数据外, 通过诱导碰撞解离(CID)模式的二级质谱实验对特征肽段进行分析, 提高了结果的可靠性. 为验证方法的实用性, 对市售4种普通牛奶和2种A2牛奶进行检测. 结果表明, 本文方法具有高可靠性、 高灵敏度等优点, 可为A2奶源筛选和A2乳制品的质量控制提供技术支持.

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

CR 21GⅢ型高速冷冻离心机(日本日立公司); FE20-K型pH计(美国Mettler Toledo公司); SI500型振荡培养箱(英国Stuart公司); ME614S型电子分析天平(德国Sartorius公司); ME36S型电子分析天平(德国Sartorius公司); Milli-Q Integral 3型超纯水仪(美国Fisher Scientific公司); 1250系列色谱仪(美国Thermo Fisher公司); Velos PRO型(LTQ)-Orbitrap高分辨串联质谱仪(美国Thermo Fisher公司); C18色谱柱(150 mm×4.6 mm, 2.6 μm, 10 nm， 美国Phenomenex公司).

聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、 牛胰蛋白酶、 牛β-酪蛋白和乙腈购自美国Sigma-Aldrich公司; 氯化钠(质量分数为99.99%)购自德国Suprapur公司; 三羟甲基氨基甲烷(Tris)购自北京GPC生物科技有限公司; 盐酸(GR)购自北京化工厂; 甲酸(体积分数为98%)购自瑞士Fluka公司； A1和A2特征肽标准品购自广东赛百威信息科技有限公司. 牛奶样品购自长春市某超市.

1.2 样品预处理

取10 mL牛奶样品, 加入40 mL的Tris-HCl溶液(50 mmol/L, pH = 8.5), 混匀, 60 ℃恒温振荡1 h. 取15 mL上述溶液, 加入15 mL NaCl溶液(0.5 mol/L, 含体积分数为0.2%的聚乙二醇辛基苯基醚), 用甲酸溶液将其pH值调至4.6[19]后, 于4 ℃静置过夜. 离心(4 ℃, 10 000 r/min, 15 min)分离出沉淀的酪蛋白. 用25 mL的Tris-HCl溶液再次溶解沉淀, 取500 μL复溶液加入100 μL胰蛋白酶(0.7 mg/mL), 加水定容至1 mL后, 加入330 μL乙腈. 37 ℃恒温反应6 h, 用20 μL体积分数为10%的甲酸溶液终止酶解反应, 样品离心(10 000 r/min, 10 min)后, 取上清液备用.

1.3 色谱-质谱条件

色谱. 流动相A: 体积分数0.1%的甲酸水溶液; 流动相B: 体积分数0.1%的甲酸乙腈溶液; 梯度洗脱程序： 50 min内将流动相B从5%线性提升至55%; 进样体积: 10 μL; 流速: 0.3 mL/min.

质谱. 电喷雾电离(ESI)正离子模式; 电压: +2 kV; 鞘气： 10; 辅助气： 2; 吹扫气： 0; 毛细管温度: 375 ℃; 轨道阱分辨率： 300 000; 质量范围(m/z)： 150～2 000; CID碰撞能: 24 eV.

1.4 数据处理

质谱数据通过仪器配备的Xcalibur®软件进行处理; A1和A2蛋白被胰蛋白酶酶解后产生的肽段序列由网站(https://web.expasy.org/peptide_cutter/)提供的Peptide-Cutter工具进行计算; 利用网站(https://prospector2.ucsf.edu/prospector/cgibin/msform.cgi?-form=msproduct)提供的MS-Product程序计算特征肽段的一级质谱和CID产物离子的理论数据.

2 结果与讨论

2.1 酪蛋白提取与酶解

为充分溶解蛋白质, 通常用尿素和二硫苏糖醇等搭配无机盐配制缓冲溶液[20], 有助于展开蛋白质空间结构, 从而提高蛋白质提取和酶解效率. 为避免污染检测器, 含有这类缓冲液的样品在液相色谱-质谱(LC-MS)分析前需进行脱盐处理. 但脱盐处理操作繁琐, 耗时长且容易导致样品损失, 因此本文开发了一种不引入盐杂质的蛋白质提取和酶解方法. 采用Tris-HCl水溶液提取酪蛋白, 在充分沉淀后经低温离心分离酪蛋白. 低温离心可减少乳蛋白中疏水基之间的相互作用, 防止乳清蛋白和酪蛋白聚集[21]. 但在酶解实验中,β-酪蛋白标准品和牛奶样品中提取的酪蛋白均未展现良好的酶解效果, 这是由于溶液中的酪蛋白处于折叠结构所致. 因此, 在酶解体系中加入可使蛋白质变性的乙腈试剂[22]. 添加乙腈显著提高了酶解效率, 同时乙腈作为液相色谱分离中的流动相B, 无需在质谱检测前进行去除. 经优化, 最终确定体积分数为25%的乙腈对酶解效率提升最明显.

2.2 液相色谱分离与质谱全扫描

使用A1和A2特征肽混合标准品溶液(15 μg/mL)优化梯度洗脱程序. 由于胰蛋白酶特异性切割蛋白质中碳端的赖氨酸和精氨酸残基[23], 因此选择包含第67位氨基酸残基的蛋白片段49～97作为区分A1和A2蛋白的特征肽段. 研究表明, 核壳结构填料的C18色谱柱对相似结构的多肽分离效果优异[24], 因此用其对A1和A2蛋白酶解后的特征肽段进行分离， 结果如图1所示. 由图1可见, 经优化后, A1和A2蛋白的特征肽段可完全分离. 分离后的肽段进入高分辨质谱进行全扫描分析, 结果如图2所示.

在一级质谱图中, A1和A2蛋白的特征肽具有不同的带电荷情况, 其中四电荷A1特征肽离子(核质比(m/z)： 1 340.72)和三电荷A2特征肽离子(m/z： 1 773.95)的信号最强, 特征肽段带电荷存在差异是由于二者的氨基酸组成不同所致[25], 即A1特征肽比A2特征肽多一个碱性氨基酸残基(67位组氨酸). 2条特征肽段检测到的分子量数据与理论数据(https://www.sisweb.com/mstools/isotope.htm)一致, 质量偏差均小于4×10-6. A1和A2特征肽段的相关信息列于表1.

2.3 牛奶中A1和A2蛋白的测定

为验证该方法的实用性, 选取市售的4种普通牛奶和2种A2牛奶进行分析, 编号1～4为普通牛奶， 5,6为A2牛奶.

采用LC-HRMS/MS方法, 通过A1和A2特征肽的色谱保留时间和一级质谱数据可确定β-酪蛋白的变体形式. 若样品中存在保留时间相近且相对分子质量相似的杂质, 则会产生不易分辨的干扰信号. 用串联质谱的二级质谱模式对其优化, 可提高检测结果的可靠性. 将特征肽进行串联质谱CID分析, 对碎片离子信息进行解析和标注, 结果如图3所示. 由图3可见， 碎片离子与理论数据吻合.

图1 A1和A2特征肽混合标准品溶液(15 μg/mL)中A1特征肽(A)和A2特征肽(B)的提取离子色谱

图2 分离后肽段的高分辨质谱

表1 A1和A2特征肽段的相关信息

图3 牛奶样品中A1(A)和A2(B)特征肽的CID谱

相比于一级质谱, 从二级质谱中得到的提取离子色谱(EIC)可排除样品中可能存在的具有相似保留时间和质量的杂质, 进一步提高了分析方法的可靠性和准确性. 在二级质谱中, 碎片离子y13是2种特征肽碎裂后信号最强的碎片离子, 所以选择该信号构建A1和A2特征肽的EIC, 结果如图4所示. 牛奶样品中A1和A2蛋白的相对含量如图5所示. 由图5可见： 在1～4号牛奶样品中可同时检测到A1和A2特征肽, 根据峰面积半定量分析, 普通牛奶中A1蛋白约为A2蛋白含量的2～4倍； 5号牛奶样品中仅存在A2特征肽信号; 6号牛奶样品中出现强度较小的A1特征肽信号, 其信号强度明显低于其本身的A2特征肽信号, 表明该样品中存在少量A1β-酪蛋白, 可能是由于筛选A2奶源所用的分析方法灵敏度较低所致.

图4 牛奶样品A1和A2特征肽的提取离子色谱(提取二级质谱中的最强信号m/z： 1 428.92)

图5 牛奶样品中A1和A2 β-酪蛋白相对含量示意图

综上所述， 本文建立了一种基于液相色谱-高分辨串联质谱方法, 通过检测蛋白被酶解后的特征肽段测定牛奶中的A1和A2蛋白. 在蛋白提取和酶解的样品处理中, 采用Tris-HCl作为缓冲液, 乙腈作为蛋白变性剂, 简化了实验操作, 缩短了实验时间. 利用检测特征肽段实现了A1 和A2β-酪蛋白的鉴别, 避免了完整蛋白质分析法中色谱分离难等缺点. 通过液相保留时间、 高分辨一级质谱和串联质谱分析, 进一步排除了可能产生的干扰信号, 提高了方法的可靠性. 通过对市售6种牛奶的分析, 该方法具有较高的稳定性和灵敏性, 可帮助企业开发A2产品和服务政府部门进行质量监管.