电化学法检测细胞中的胸腺嘧啶和胞嘧啶

张树萌， 李锦莲， 郭晓玲， 孟令仁， 周 实

(佳木斯大学 药学院， 黑龙江 佳木斯 154007)

胸腺嘧啶和胞嘧啶是两种重要的嘧啶分子， 存在于脱氧核糖核酸(DNA)中并参与细胞嘧啶核苷酸的代谢， 可调控血流、 预防心律失常、 抑制神经递质释放并调节腺苷酸环化酶活性[1-2]. 胸腺嘧啶和胞嘧啶的含量是诊断癌症、 艾滋病、 心肌细胞能量状态、 疾病治疗进展评价的重要参数[3-4]. 由于核苷酸、 核苷及其碱基的定量检测在生物医学、 生理学和临床研究领域应用广泛， 因此测定胸腺嘧啶和胞嘧啶的含量或它们在DNA中的比例已引起人们广泛关注[5]. 生物样品中胸腺嘧啶和胞嘧啶定量分析的常用方法有高效液相色谱法(HPLC)[6]、 质谱法(MS)[7]、 凝胶电泳法[8]等. 但在实际应用中存在样品前处理复杂、 仪器昂贵、 不便携带、 需要衍生或需结合其他检测方法等问题. 电化学分析法[9-13]具有较高的灵敏度、 重现性、 简便性、 样品前处理简单、 成本低、 可实时检测等优点. 其中， 基于嘌呤核苷酸代谢的细胞电化学法已用于评价环境雌激素效应、 检测典型环境污染物(重金属、 氯酚类)的细胞毒性等[14-15].

文献[16]制备了氧化石墨烯量子点/多壁碳纳米管修饰的丝网印刷电极(GOQDs/MWCNTs/SPCE*)， 构建微型反应装置， 在较宽的电位窗下实现了尿酸与嘌呤的同时检测. 本文利用基于GOQDs/MWCNTs/SPCE*的电化学检测方法对胸腺嘧啶和胞嘧啶标准品进行同时检测， 考察最佳检测条件， 研究电极对两种嘧啶分子的选择性和灵敏度， 实现电化学法同时测定小鼠胚胎成纤维(BALB/c 3T3)细胞中的胸腺嘧啶和胞嘧啶， 为嘧啶分子的灵敏快速检测提供新技术方法.

1 实 验

1.1 试剂与仪器

小鼠胚胎成纤维细胞(BALB/c 3T3， 中科院上海细胞库); DMEM培养基(Dulbecco’s modified eagle medium， 美国Gibco公司); 氧化石墨烯量子点(GOQDs， 南京先丰纳米材料科技有限公司); 高纯多壁碳纳米管(MWCNTs， 深圳纳米港有限公司); 尿酸(UA)， 黄嘌呤(X)， 鸟嘌呤(G)， 腺嘌呤(A)， 次黄嘌呤(HX)， 胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)均购自美国Sigma公司; 其他试剂均为国产分析纯试剂.

恒电位仪(CHI 660型， 上海辰华仪器有限公司); 丝网印刷电极(SPCE， SE100型， 台湾地区Zensor R&D公司); 高效液相色谱仪系统(G1311Agilent 1100型， 德国安捷伦科技有限公司); 二氧化碳恒温培养箱(311型， 美国Thermo公司); 倒置荧光显微镜(CKX41型， 日本Olympus公司); 培养皿(D8054型， 美国Sigma公司); 培养板(3603型， 美国Corning公司); 超洁净工作台(VS-1300U型， 苏州华宇净化设备有限公司).

1.2 细胞培养与收集

细胞在含10%胎牛血清、 1% 100 μg/mL青霉素和链霉素的DMEM培养基中于37 ℃、 φ(CO2)=5%的细胞培养箱中培养. 除去培养皿中的培养基， 加入一定量的磷酸盐缓冲液(PBS)于水浴锅中, 50 ℃裂解后进行电化学检测[8].

1.3 电化学检测方法

GOQDs/MWCNTs/SPCE*的制备过程参照文献[16]， 在电化学分析仪上， 用微分脉冲伏安(DPV)法于25 ℃进行电化学检测， 三电极体系包括GOQDs/MWCNTs/SPCE*工作电极， Ag/AgCl/KClsat参比电极和铂丝对电极.

1.4 高效液相色谱检测

检测条件： Ascenis RP-Amide型色谱柱(4.0 mm × 250 mm × 5.0 μm); 检测波长： 254 nm; 柱温： 25 ℃; 流动相： 0.02 mmol/L pH=4.9的KH2PO4溶液; 流动相流速： 1.0 mL/min; 进样量： 20 μL. 样品用0.22 μm微孔滤膜过滤后进样检测.

1.5 数据处理与分析

用Origin 2018软件绘图.

2 结果与讨论

2.1 胸腺嘧啶和胞嘧啶的电化学行为

用已构建的电化学检测系统[16]对胸腺嘧啶(50 μmol/L)和胞嘧啶(100 μmol/L)标准品进行检测， 两种混合物在不同电极上的DPV曲线如图1所示. 对比5个电极， GOQDs/MWCNTs/SPCE*电极在1.15，1.30 V处有2个明显的电化学信号， 分别归属于胸腺嘧啶和胞嘧啶的氧化峰. 由图1可见， GOQDs/MWCNTs/SPCE*电极对胸腺嘧啶和胞嘧啶的电化学响应较强.

2.2 富集电位对胸腺嘧啶和胞嘧啶电化学信号的影响

富集电位、 富集时间和pH值等因素均影响电极对样品的检测效率. 为研究富集电位对胸腺嘧啶和胞嘧啶在GOQDs/MWCNTs/SPCE*电极上电化学行为的影响， 在不同富集电位(-0.3，-0.2，0，0.2，0.3 V)下测定胸腺嘧啶和胞嘧啶标准样品的电化学信号， 富集时间为360 s， 结果如图2所示. 由图2可见， 富集电位对胸腺嘧啶和胞嘧啶的氧化峰电流影响较小. 因此， 选取0为最佳富集电位.

图1 胸腺嘧啶和胞嘧啶混合物在不同电极上的DPV曲线

图2 富集电位对胸腺嘧啶和胞嘧啶氧化峰电流的影响

2.3 富集时间对胸腺嘧啶和胞嘧啶电化学信号的影响

图3 富集时间对胸腺嘧啶和胞嘧啶氧化峰电流的影响

图3为不同富集时间下胸腺嘧啶(150 μmol/L)和胞嘧啶(150 μmol/L)标准样品的电化学曲线， 富集时间分别为0,90,150,240,300 s. 由图3可见， 随着富集时间的增加， 氧化峰电流小幅度增加， 150 s后峰电流随富集时间的增加基本无变化. 这可能是富集150 s时， 样品在电极表面上的吸附达到了饱和状态， 因此选取150 s为最佳富集时间.

2.4 pH值对胸腺嘧啶和胞嘧啶电化学信号的影响

图4为不同pH值(5.90，6.58，7.40，8.66，9.50，10.55)下胸腺嘧啶(150 μmol/L)和胞嘧啶(150 μmol/L)的氧化峰电位和氧化峰电流的变化. 由图4(A)可见， 胸腺嘧啶和胞嘧啶的氧化峰电位随pH值的增加而负移， 表明质子参与了电化学反应[14]. pH值与峰电位呈一定的线性关系， 线性方程分别为

ET= 1.509 9-0.049 0pH (R2= 0.990 8)，

EC= 1.534 7-0.034 6pH (R2=0.990 6).

两个方程的斜率值分别为0.049 0，0.034 6， 与理论值0.059，0.029接近， 表明胸腺嘧啶和胞嘧啶在电极表面分别发生了两电子和单电子的氧化反应[15]. 由图4(B)可见， 胸腺嘧啶和胞嘧啶的峰电流随pH值的减小而增加， 当pH=7.4时， 电极对胸腺嘧啶和胞嘧啶的电化学响应较强， 且细胞的生理pH=7.4， 因此选取pH=7.4为检测条件.

2.5 GOQDs/MWCNTs/SPCE*的选择性和灵敏度

为考察基于GOQDs/MWCNTs/SPCE*的检测系统对胸腺嘧啶和胞嘧啶混合溶液的选择性， 在最佳检测条件下， 通过改变一种物质浓度而另一种物质浓度保持不变绘制电化学曲线， 结果如图5所示. 由图5可见， 随着待测物质浓度的增加， 其氧化峰电流增加， 而浓度保持不变的另一种物质的电化学信号没有变化. 基于GOQDs/MWCNTs/SPCE*的微检测系统可灵敏检测到胸腺嘧啶和胞嘧啶电化学信号的变化， 分别在5～340 μmol/L和5～430 μmol/L内， 两种物质的浓度与氧化峰电流呈良好的线性关系. 对应的线性方程分别为

IT=17.138 0+0.157 9c(R2=0.996 8)，

IC=34.749 2+0.135 18c(R2=0.998 6)，

且最低检测限分别为0.69，0.95 μmol/L.

图4 pH值对胸腺嘧啶和胞嘧啶氧化峰电位(A)及氧化峰电流(B)的影响

(A) a～l: c(T)=5,25,50,85,110,140,185,220,240,270,310,340 μmol/L; (C) a～m: c(C)=5，25，50，75，100，120，180，230，280，320，360，390，430 μmol/L.

2.6 细胞中胸腺嘧啶和胞嘧啶的检测

高效液相色谱(HPLC)法常用于定量检测生物小分子[7]. 将BALB/c 3T3细胞悬浮液及加入尿酸、 黄嘌呤、 鸟嘌呤、 腺嘌呤、 次黄嘌呤、 胸腺嘧啶和胞嘧啶的细胞悬浮液用HPLC法进行对比， 结果如图6所示， 其中测试细胞的浓度为每毫升106个细胞. 由图6可见， 胞嘧啶和胸腺嘧啶的保留时间分别为4.20，13.32 min. 利用内标法检测加入的7种标准品， 只有6个信号发生变化. 原因是细胞中还存在大量嘌呤， 胸腺嘧啶与黄嘌呤的出峰位置接近且无法分离(图6(B))， 因此用HPLC法无法同时检测到BALB/c 3T3细胞中胞嘧啶和胸腺嘧啶的出峰位置， 仅能检测到胞嘧啶.

红线： BALB/c 3T3细胞悬浮液; 黑线： 细胞悬浮液和尿酸、 黄嘌呤、 鸟嘌呤、 腺嘌呤、 次黄嘌呤、 胸腺嘧啶、 胞嘧啶混合物.

用基于GOQDs/MWCNTs/SPCE*的细胞电化学法对BALB/c 3T3细胞样品进行检测， 结果如图7所示. 由图7可见， 在细胞裂解液中检测到位于0.28，0.65，0.92，0.97 V处存在4个电化学信号[17-18]. 与尿酸和嘌呤标准样品对比， 4个电化学信号分别归属于细胞中尿酸、 黄嘌呤/鸟嘌呤、 腺嘌呤和次黄嘌呤的氧化. 细胞裂解液中检测到位于1.15，1.30 V处的2个电化学信号归属于细胞中胸腺嘧啶和胞嘧啶的氧化. 可见， 基于GOQDs/MWCNTs/SPCE*的细胞电化学法可实现细胞中胸腺嘧啶和胞嘧啶的同时检测.

红线： BALB/c 3T3细胞； 黑线： 尿酸、 黄嘌呤/鸟嘌呤、 腺嘌呤、 次黄嘌呤、 胸腺嘧啶和胞嘧啶标准品混合物.

综上所述， 本文用基于GOQDs/MWCNTs/SPCE*的电化学检测方法考察了富集电位、 富集时间、 pH值等因素对胸腺嘧啶和胞嘧啶标准品电化学行为的影响， 获得最佳检测条件为富集电位0， 富集时间150 s， pH=7.4; 电极对胸腺嘧啶和胞嘧啶的最低检测限分别为0.69，0.95 μmol/L. 该方法实现了BALB/c 3T3细胞中胸腺嘧啶和胞嘧啶的同时灵敏检测， 为生物样品中嘧啶分子的灵敏快速检测提供了一种新技术方法.