短小芽孢杆菌非编码RNA Bpsr145的鉴定及初步探究

宋 婷，徐云帆，贺婷停，覃 佳，黄 宇，王海燕

(四川大学生命科学学院/生物资源与生态环境教育部重点实验室，四川 成都 610065)

【研究意义】过去10年，细菌小非编码 RNA (small non-coding RNA，又称sRNA) 的发现和功能识别已经受到广泛研究。sRNA通常是由50～500个核苷酸组成，主要由细菌染色体的基因间隔区编码产生，绝大多数sRNA不编码蛋白质，由于sRNA的不完全碱基配对机制使一个sRNA可以与多个靶基因作用，调节不同的生物学过程[1]。短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)属于芽孢杆菌属，是一类重要的生防细菌，它可以分泌抗菌肽、抗菌蛋白以及抗菌素等多种物质，对于多种致病病原菌均有明显的抑制作用，如Zheng Min等[2]研究发现B.pumilus对于芒果炭疽病的抑制率高达94.28 %。对短小芽孢杆菌中的sRNA研究可以揭示其更多作用机制。【前人研究进展】目前已有大量sRNA被报道，功能得到研究的sRNA大多来自于革兰氏阴性菌大肠杆菌和沙门氏菌。如大肠杆菌中，GcvB是一个长度为206 nt的sRNA，主要功能是调控氨基酸转运和多肽转运相关基因的表达[3]；sRNA RyhB可以通过与铁储存蛋白(如Bfr)和非必需的铁硫蛋白(如超氧化物歧化酶sodB，sdhCDAB操纵子)等基因的mRNA结合而抑制这些蛋白的产生[4]。另外在其他菌株中也有少量发现，如Robert Hertel等[5]发现枯草杆菌的sRNA AprAs可以通过与aprmRNA结合抑制枯草杆菌蛋白酶的表达，阻止该sRNA转录可以提高Apr蛋白表达量，蛋白酶活性增加约4倍；另外，Jiakun Qi等[6]证明了sRNA s015可以通过提高LactococcuslactisF44的耐酸性而提高乳链菌肽的产量。【本研究切入点】B.pumilusSCU11是实验室早期从土壤中分离并经过复合诱变得到的菌株，前期采用链特异性转录组测序技术研究了该菌在发酵过程中9个时间点的转录组，并利用生物信息学技术预测出84个大于50 nt的候选非编码sRNA，Bpsr145是一个长209 nt的候选非编码sRNA，在不同时间表达水平有较大差异。【拟解决的关键问题】通过Northern blotting和独立转录验证Bpsr145的表达，使用不同的程序对其序列保守性、二级结构以及靶标基因进行分析，建立敲除菌株为探究该sRNA的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒

B.pumilusSCU11是实验室早期从土壤中分离并经过复合诱变得到的；pSUGV4[7]和pUCETs[8]均是E.coli-Bacillus穿梭载体。

1.2 RNA提取和Northern blotting

新鲜的菌液在7500 r/min条件下离心10 min收集菌体，利用TRizol方法提取RNA。Northern杂交电泳的上样量为10 μg总RNA，用2 %的琼脂糖甲醛变性电泳，电泳条件：65 V, 2 h；将RNA转移到带正电荷的尼龙膜上，转膜液为20×SSC，过夜转膜；然后使用紫外交联仪进行交联，能量为1600×100 μJ/cm；杂交、洗涤、显色：按照Roche公司的DIG Northern Starter Kit试剂盒方法进行。

1.3 独立转录载体的构建

以pSUGV4为载体，构建独立转录质粒。以基因组DNA为模板，Bpsr145-F/R (F: 5’-CCAAGCTTGCATGCCTGCAGAGTAGATGCCTTAGCAGATGTGG TC-3’, R: 5’-CGGTACCCGGGGATCCTAGACAAAC CCTCGCATTCGG-3’) 为引物扩增得到包括Bpsr145启动子和终止子的完整序列片段，将该片段通过TAKARA公司的In-fusion试剂盒插入经PstI和BamHI双酶切的pSUGV4质粒，连接产物转化大肠杆菌，得到重组质粒pSUGV4 (145) 。

1.4 敲除载体的构建

以实验室构建的温度敏感型质粒pUCETs为载体，构建基因敲除质粒。首先在编码Bpsr145的基因上、下游区域分别设计用于同源重组的同源臂，以基因组DNA为模板，Bpsr145-1F/R(1F:5’-CAAGCTTGCATGCCTGCAGATGGTGAGAGTGGGGC

AGA-3’, 1R:5’-CGTCATCATCTGTATGAATCTCCTTGCAAATCTTCTTGAGC-3’) 和Bpsr145-2F/R (2F:5’-GAACGATGACCTCTAATAATTGTCCTTGCAAATC TTCTTGAGC-3’,2R: 5’-CGGTACCCGGGGATCCAATGGGACAGTCATCGCCT-3’) 为引物扩增得到上、下游同源臂Flank1 (742 bp) 和Flank2 (676 bp) ，以质粒pSUGV4为模板，kan-F/R (F: 5’-GATTCATACAGATGATGACG-3’, R:5’-CAATTATTAGAGGTCATCGTTC-3’) 为引物扩增出kan基因片段 (1047 bp) ，利用重叠PCR将3个片段连接起来得到Flank1-kan-Flank2 (2465 bp) 片段。将该融合片段通过TAKARA公司的In-fusion试剂盒插入经PstI和BamH I双酶切的pUCETs质粒，连接产物转化大肠杆菌，得到敲除载体pUCETs-145。

1.5 短小芽孢杆菌电转化实验

根据前期实验室建立优化的电转化方法[8]进行。

1.6 RNA结构分析

Mfold Web服务器用于预测折叠RNA的结构，包括sRNA和靶标mRNA[9]。

1.7 靶基因的预测

使用2个不同程序获得靶基因预测：CopraRNA[10]和TargetRNA2[11]，CopraRNA是使用的本地服务器版本，TargetRNA2可从网页上获取：http://cs.wellesley.edu/～btjaden/TargetRNA2/。

1.8 生长曲线测定

将保存的菌株划线在1 %的牛奶LB平板上37 ℃过夜活化，选取单菌落接种于LB液体培养基，震荡过夜。以4 %比例转入50 mL LB培养基中，于37 ℃摇床中180 r/min振荡培养，隔一定的时间进行取样，适当稀释用分光光度计测定OD600nm数值。

1.9 胞内蛋白SDS-PAGE

将2个菌株过夜活化，以1 %比例分别转种于LB培养基中培养18 h，将2个菌悬液调整至OD600nm值为1.0，取6 mL稀释菌液用PBS缓冲液洗2次，然后用0.6 mL PBS缓冲液重新悬浮，取0.5 mL菌液以1∶1的比例与100～200 μm规格的玻璃珠混合，在细胞研磨机器上研磨，然后取出破壁后的样品与loading buffer混匀，100 ℃变性10 min后各取20 μl样品进行SDS-PAGE。

2 结果与分析

2.1 转录组数据揭示Bpsr145是一个差异表达的sRNA

前期采用链特异性转录组测序技术研究了B.pumilusSCU11在发酵过程中不同时间的转录组,从中预测出84个候选非编码sRNA。本研究首先对转录组数据中Bpsr145在不同时间点的表达水平进行分析，比较该sRNA及其邻近染色体区域的reads覆盖情况，了解Bpsr145和附近基因的转录水平。研究发现Bpsr145的表达量在不同时间点变化较大(图1-A),24 h之前表达水平很低，从36 h开始出现显著升高，48 h表达量达到峰值，然后开始下降，由此初步推测Bpsr145发挥功能的主要时期是在36～60 h。Bpsr145位于染色体RI02_RS03660(编码假设蛋白)和RI02_RS03665(编码甲硫氨酸氨基肽酶)2个基因的间隔区，运用生物信息学方法分析发酵48 h时Bpsr145及其上下游基因编码区的reads覆盖情况(图1-B)，结果显示：Bpsr145与上游基因反向部分重叠，由不同的链转录产生；与下游基因转录方向相同但是距离较远，并且中间间隔区域在不同时间点几乎没有reads覆盖。综合这些可以推测Bpsr145是一个独立转录的sRNA。

2.2 Bpsr145的实验验证

Bpsr145的生物信息学分析显示该sRNA是一个独立转录的sRNA，但仍需进一步实验验证，Northern blotting被认为是验证sRNA的金标准。以LB培养基中培养48 h的短小芽孢杆菌总RNA 作为样品进行Northern blotting实验，结果显示出一条清晰的杂交条带，说明Bpsr145在B.pumilusSCU11中真实转录，实际大小与预测的209 nt接近(图2-A)。

通过异源表达实验验证Bpsr145是否能独立转录。Bacillussubtilis168是芽孢杆菌的模式菌株，B.subtilisWB600是敲除B.subtilis168 中6个蛋白酶基因的改造菌株，将Bpsr 145序列与其基因组对比，并未发现同源序列，因此用该菌株作为Bpsr145异源表达的宿主。利用短小芽孢杆菌电转化方法，将包含Bpsr145启动子和终止子完整序列的重组质粒pSUGV4 (145) 转入B.subtilisWB600中，得到转化菌株WB600-GV4 (145)，提取转化菌株的RNA，用特异性引物进行RT-PCR(图2-B)，结果显示插入的Bpsr145片段能在B.subtilisWB600发生独立转录，表明短小芽孢杆菌中Bpsr145是一个独立的转录单元。

为了揭示Bpsr145在不同培养条件下的表达情况，分别用LB完全培养基和M9基本培养基培养B.pumilusSCU11，提取不同培养时期的RNA样品通过Northern blotting分析Bpsr145的差异表达情况。结果(图2-C)显示，在LB培养基中，Bpsr145在12 h时开始出现表达，24 h表达水平达到最高，在36～60 h又出现第2次逐步增加的趋势。在M9基本培养基中，不同的时间点都有表达且差异不大，说明Bpsr145在胁迫条件下表达水平更高。

2.3 Bpsr145的生物信息学分析

细菌非编码RNA研究表明，除了极少数的sRNA具有高度保守的特性外，大多数sRNA的序列保守性范围相对狭窄，通常只在同一属或同一种的不同菌株中存在一定的保守性。将Bpsr145序列进行nBlast比对，得到该序列与43个芽孢杆菌基因组间的保守性结果：与Bpsr145具有全长相似性的有36个菌株，相似性大于96 %，其中有15个菌株序列一致性达到了100 %，包括B.pumilus,Bacillusaltitudinis以及Bacilluscellulasensis的一些菌株，图中显示了该序列与36个菌株之间的系统进化树(图3-A)，还有7个菌株只与Bpsr145序列的后半段 (77～209 bp) 具有相似性，包括B.subtilis和B.atrophaeus的一些菌株。另外通过Mfold软件对Bpsr145的二级结构进行预测(图3-B)，结果显示该sRNA具有小调控RNA广泛存在的分子内碱基配对的特征结构，包含多个茎环结构，sRNA的二级结构决定了靶标特异性,它们的特定区域负责维持其稳定性并与靶标mRNA的RBS和/或编码序列(CDS)结合。

A：系统进化树，内部红色框表示含有与Bpsr145完全一致的序列的15个芽孢杆菌基因组;B：二级结构A: Phylogenetic tree of Bpsr145, the inner red box indicates 15 genomes which have the completely conserved sequence with Bpsr145;B: Secondary structure图3 Bpsr145序列保守性和二级结构分析Fig.3 Analysis of sequence conservative and secondary structure of Bpsr145

大多数位于基因间隔区的sRNA是通过与靶mRNA间不完全的碱基配对来发挥调控作用，配对区通常约10～25 bp。本实验采用TargetRNA2和CopraRNA对Bpsr145进行靶基因预测，两种软件分别预测出41和200个靶基因，结果总结在韦恩图中(图4-A)。两种软件均预测到的靶基因只有5个(图4-B)，其中3个有注释信息，其余2个为未知基因：queG编码tRNA环氧鸟苷还原酶，与tRNA修饰相关；prepB编码蛋白质-精氨酸磷酸酶，与氨基酸的磷酸化相关；hepT编码庚二烯基二磷酸合酶组分Ⅱ，参与甲萘醌-7(维生素K2-7)侧链的生物合成。其他的靶基因主要涉及能量产生与转变、无机离子的转运与代谢、细胞能动性等相关功能。通过分析靶标mRNA功能，可以预测sRNA参与调节的相关生物学过程。

A：维恩图显示了由TargetRNA2和CopraRNA预测到的靶基因;B： 2个软件均预测到的靶基因A: Venn diagram shows the target genes predicted by TargetRNA2 and CopraRNA;B: The target genes are predicted by two programs图4 Bpsr145调控的靶基因预测Fig.4 Prediction of target genes

2.4 Bpsr145敲除菌株的构建及与野生型菌株对比

生物信息学分析、Northern blotting和独立转录实验结果表明，Bpsr145是B.pumilusSCU11中独立转录、差异表达的sRNA，要进一步研究该sRNA在短小芽孢杆菌中所参与的生理功能，最直接的方法就是建立sRNA的敲除菌株。利用带有温度敏感型复制起点的E.coli-Bacillus穿梭载体pUCETs构建Bpsr145敲除载体pUCETs-Bpsr145，然后通过电转化的方法将载体转入野生型菌株SCU11内，筛选基因敲除菌株，通过PCR和测序验证染色体上Bpsr145被kan基因取代，Bpsr145基因被成功敲除，将敲除菌株命名为B.pumilusSCU11 (Δ145) 。

首先对敲除菌株与野生型菌株在LB培养基中的生长情况进行比较，2个菌株的生长曲线显示 SCU11 (Δ145) 在进入对数期后比野生型菌株长得慢但差别不是很大，培养至24 h，野生型菌株SCU11进入稳定期，敲除菌株SCU11 (Δ145) 菌株直接进入衰亡期(图5-A)。另外测定了2个菌株在M9基本培养基中的生长曲线，得到的结果与LB培养基的结果一致，两株菌没有明显差别(结果未显示)。为了检测Bpsr145的敲除是否影响某些蛋白的表达水平，收集培养至18 h的菌株提取胞内蛋白进行SDS-PAGE分析(图5-B)，发现突变菌株与野生菌株在胞内蛋白产生上也无显著差别。

除此以外，根据靶基因的预测及其涉及的生物学过程，对菌株在不同温度下(低温25 ℃，正常培养温度37 ℃以及高温45 ℃)和铁胁迫条件下 (10 μmol/L FeSO4) 的生长状况以及菌株的运动性进行测定，结果均未发现明显的表型差异。

3 讨 论

Bpsr145是笔者在短小芽孢杆菌SCU11转录组数据库中预测到的一个新的非编码sRNA，本研究通过Northern blotting和独立转录实验证实Bpsr145的真实转录,长度与预测大小209 nt相近。进一步对Bpsr145所在基因间隔区域进行开放阅读框分析，发现了一个长138 bp的开放阅读框，该开放阅读框与Bpsr145的转录方向相同，起始密码子位于Bpsr145序列中间，终止于Bpsr145的3’端后面22个碱基的位置。由于Bpsr145确切的转录起始位点并未确定，所以Bpsr145基因是否同时也编码一个小肽呢？过去常认为sRNA是不编码蛋白质的，但是随着研究的深入发现某些sRNA同时还可以编码小肽，这类sRNA被称为双功能sRNA。例如大肠杆菌中的sRNA SgrS就是一个双功能的sRNA，既具有与靶标mRNA碱基配对功能，又可以编码一个长43个氨基酸的小肽SgrT[12]。另外Matthias Gimpel 等[13]发现枯草芽孢杆菌中的SR1也是一个具有明确双功能的sRNA，一方面，它以RNA形式与精氨酸代谢相关的转录激活因子abrCmRNA的SD序列结合，抑制abrCmRNA的翻译；另一方面，SR1还能编码一个长39个氨基酸的小肽SR1P，SR1P能与GapA蛋白结合，从而稳定gapAmRNA。到目前为止，已报道的双功能sRNA数量很少，Bpsr145是一个单纯的非编码sRNA还是双功能的sRNA，这些还有待更多的实验证实。

A：生长曲线;B：SDS-PAGE实验A: Growth curve;B: SDS-PAGE图5 敲除菌株与野生型菌株对比研究Fig.5 Comparative study between knock-out and wild strain

本实验构建了sRNA Bpsr145的突变菌株，结果发现Bpsr145的敲除对菌株生长过程无明显影响，胞内蛋白的SDS-PAGE分析也显示胞内表达水平高的蛋白条带无明显区别，但并不排除低表达水平的蛋白存在差异。根据已经研究出功能的sRNA来看，sRNA的主要作用是参与各种胁迫应答及毒力基因的表达，包括渗透压胁迫、酸性胁迫或氧化胁迫等，如大肠杆菌中sRNA RprA，在渗透压刺激下通过碱基配对来促进RpoS合成，使其适应环境[14]；又如sRNA OxyS在氧化应激过程中被诱导产生，OxyS可以抑制fhlA和rpoSmRNA的翻译，他们分别编码RNA聚合酶的转录基活因子和σs亚基[15]。综合对Bpsr145靶基因的预测结果，其中desK与温度信号传导相关，fur与铁离子代谢相关，flgD与细菌的运动性相关，本研究对2个菌株不同温度下的生长状况、铁胁迫下生长状况、以及菌株的运动性进行了测定，结果2个菌株的生长均并未出现明显差异，说明Bpsr145可能不参与这些生理功能的调控，或者Bpsr145在这些功能中只起到协调作用，对表型的影响并不明显。其他研究者也有类似的发现，很多时候sRNA突变菌株并不会产生明显的表型变化[16]：一方面的原因可能是由于很多sRNA主要发挥协调作用而非核心调节因子，另一方面可能因为大多数的sRNA是细菌胁迫应答的产物，因此突变菌株的表型改变可能是针对特定生理条件下的细微变化。

4 结 论

本课题通过Norther blotting和独立转录实验证实sRNA Bpsr145是存在于B.pumilusSCU11中的一个sRNA，并通过Northern blotting实验进一步确认了该sRNA在不同培养条件不同生长时期存在着明显的差异表达，这也表明Bpsr145可能在某个生理过程中发挥着作用。对Bpsr145缺失菌株进行了初步分析，目前为止并没有确认Bpsr145的具体功能，但是通过对短小芽孢杆菌sRNA的研究，一方面可以丰富芽孢杆菌sRNA数据库，另外也为研究短小芽孢杆菌的作用机制提供一个新思路。