内生真菌FXZ2对玉米生长及重金属累积的影响

朱政清，白维晓，汤雯婷，李海燕

(昆明理工大学医学院，云南 昆明 650500)

【研究意义】土随着工业化和城市化进程的加快，土壤重金属污染问题日趋严重。在中国，已有近1/6的耕地(约2000万km2)受到了不同程度的重金属污染，给原本就有限的耕地资源带来了沉重的负担[1-2]。此外，由于土壤重金属具有较强的隐蔽性、自然条件下难以降解，其危害往往是多层次、多方面的。在世界范围内，已有许多关于土壤重金属污染引起人类疾病的报道[3]，其中包括人体生殖功能疾病，造成胎儿畸形生长，影响儿童和成人的身体素质，对人们正常生活造成威胁等[2]。因此，污染土壤的修复成为环境研究热点之一。【前人研究进展】目前的修复方法主要有物理修复、化学修复和生物修复等。在所有修复方法中，植物微生物联合修复因其原位、环保、费用低、操作简单等特征在重金属污染土壤修复中展现出较好的应用前景[4-6]，其中植物-内生菌联合修复已经取得了一定进展[7-10]。内生菌指生活在健康植物组织内部，不引起宿主植物明显症状改变的微生物。由于与宿主植物协同进化，形成互利共生关系，一方面内生菌可以从植物获取营养和避难所，反过来，内生菌也能增强宿主植物的抗逆性[11]。在重金属胁迫环境中，植物内也定殖有一定数量的内生菌[12-13]。内生菌通过产生抗氧化酶、植物促生激素、脱氨酶和脱羧酶等增强植物的抗氧化能力，提高其重金属抗性，促进其生长发育，降低重金属对植物的伤害，在提高宿主生物量的同时，增加植物对重金属的吸收和积累，提高修复效率[14]。有研究表明，植物内生菌具有吸附(收)重金属的能力，从而起到固定重金属离子，降低其在植株内部的含量，从而减轻重金属胁迫强度[15]。【本研究切入点】通过前期研究，从重金属超富积植物小花南芥(Arabisalpina)的种子分离获得一株重金属耐受菌株FXZ2(黑附球菌，Epicoccumnigrum)，在重金属胁迫条件下，该菌株能够显著促进小花南芥的生长，影响其重金属累积能力。【拟解决的关键问题】探索菌株FXZ2对玉米生长及重金属累积的影响，为FXZ2的应用、以及内生菌与植物互作机制的探索提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试玉米种子为云南曲辰种业股份有限公司生产的会单4号(滇玉14号)玉米种子。

矿渣堆土壤样品于2017年8月10日采于云南省曲靖市会泽县(26°28′N, 103°37′E，海拔2273 m)。采回的土壤样品于室温下自然风干、备用。

1.2 无菌苗的获得

随机挑选玉米种子按下列程序进行表面消毒：用体积分数为75 %的乙醇溶液表面消毒10 min，后用无菌水漂洗6次，再用有效氯体积分数为10 % NaClO溶液表面消毒10 min，无菌水漂洗6次，并于无菌滤纸上吸干水分，均匀放置在8 g·L-1的水琼脂培养基中，于25 ℃下避光培养3 ～ 5 d。待种子萌发后，选取无污染且长势一致的玉米幼苗备用。

1.3 土壤基质的制备与无菌苗的培养

复合重金属污染土壤的制备：将矿渣堆土过5 mm筛，去除其中的石块和植物残渣，之后加入珍珠岩(土壤∶珍珠岩的体积比为7∶3)，混合均匀后121 ℃灭菌20 min，间歇3次，每次间隔24 h，室温下冷却、备用。

不同含量Cd污染土壤的制备：按V加拿大水藓泥炭∶V珍珠岩= 7∶3制备混合土壤，然后分别加入不同量的氯化镉，制成Cd质量分数为0 、5 、15、30 mg·kg-1的土壤，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min，间歇灭菌3次，每次间隔24 h，室温下冷却、备用。

将长势一致的玉米幼苗随机移栽至不同重金属污染的土壤中，于室温下(18 ～ 25 ℃)自然光照培养。

1.4 FXZ2接种剂和灭活剂的制备及接种

在PDA培养基中活化菌株FXZ2后，接种到PDB培养基中，置于28 ℃、130 r/min的摇床上培养3 d。之后过滤、取菌丝，转移至500 mL无菌水中打散制成菌悬液，再将其平均分成2组，一组为FXZ2接种剂，另一组于121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min制成FXZ2灭活剂。

将制备好的FXZ2接种剂与灭活剂分别接种到处理组和对照组幼苗上，每株接种3 mL，使其完全湿透。在第1次接种后的第7 、15、30天再各接种1次，共接种4次。

1.5 植物生理指标测定

1.5.1 叶绿素含量测定 在玉米培养37 d后，用叶绿素计(日本柯尼卡美能达公司，SPAD-502 Plus)测定玉米叶片中叶绿素含量[16]。

1.5.2 生物量测定 培养37 d后，将整株植物自土壤中取出，并在自来水下冲洗干净，用无菌滤纸吸去水分后，测量株高、根长和鲜重。之后将植物放入65 ℃烘箱中，烘至恒重并测量干重。

1.6 植物及土壤中重金属含量的测定

1.6.1 植物样品中重金属含量的测定 将烘至恒重的植物样品分为地上和地下两个部分，分别进行重金属含量的测定[17]。方法如下：将待测样品置于研钵中，研磨成粉末。称取200 mg粉末放入消化管中，加入5 mL HNO3(65 % w/w)浸泡过夜。隔天将样本分别在80 ～ 90、100 ～ 110 和100 ～ 110 ℃的消化炉中消解30、30和60 min，消解后冷却，加入1 mL H2O2(30 % w/w)，再分别于100 ～ 110和120 ～ 130 ℃的消化炉中消解30和60 min，消解后冷却，用三蒸水定容至50 mL，通过火焰原子吸收分光光度法测定其重金属含量。

1.6.2 土壤样品中重金属含量的测定 分别取各处理组植物，按照抖根法[18]收集根际土，并于室温下自然风干，用5 mm筛除去土壤中残留的植物根系，再进行研磨，过100目筛后测定其重金属含量[19]：称取500 mg待测土壤粉末放入消化管中，加入4 mL HCl-HNO3(3∶1 v/v)混合液浸泡过夜。隔天将分别在80 ～ 90 、100 ～ 110 和120 ～ 130 ℃的消化炉中消解30 、30和60 min，消解后冷却，加入1 mL HClO4，再分别于100 ～ 110和120 ～ 130 ℃的消化炉中消解30和60 min，消解后冷却，用三蒸水容至50 mL，通过火焰原子吸收分光光度法测定其重金属含量。

Mean ± SE，n=30；*代表处理组与对照组有显著差异(P<0.05),下同Mean ± SE，n=30, * indicated that there was significant difference between the experimental group and the control(P<0.05), the same as below图1 复合重金属胁迫下菌株FXZ2对玉米生长的影响Fig.1 The effect of FXZ2 on maize growth under multiple-HMs stress

2 结果与分析

2.1 复合重金属胁迫下内生真菌FXZ2对玉米生长及重金属累积的影响

在复合重金属胁迫下，接种FXZ2(处理组)的玉米存活率为96.7 %，而接种FXZ2灭活剂(对照组)的玉米存活率为83.3 %(图1)。从图1可以看出，接种菌株FXZ2显著促进了玉米的生长，处理组玉米的株高、根长、鲜重和干重均明显高于对照组(P<0.05)，分别提高了14.03 %、18.82 %、60.69 %和28.89 %。

在复合重金属胁迫下，处理组与对照组玉米地上部分、地下部分及土壤中Pb、Zn、Cd含量如图2、图3～4所示。结果表明，处理组玉米地上部分Zn、Cd含量明显低于对照组(P<0.05)，分别降低了7.87 %和8.11 %，Pb含量略低于对照组但差异并不显著；相反，处理组玉米地下部分Pb含量明显高于对照组(P<0.05)，提高了17.57 %，Zn含量高于对照但差异并不显著，而Cd含量明显低于对照组(P<0.05)，降低了4.55 %。处理组根际土壤中Pb、Zn含量明显低于对照组(P<0.05)，分别降低了8.27 %和16.06 %，而Cd含量高于对照组但差异并不显著。

图2 复合重金属胁迫下菌株FXZ2对玉米地上部分重金属含量的影响Fig.2 The effect of FXZ2 on aerial parts of maize HMs concentration under multiple-HMs stress

图3 复合重金属胁迫下菌株FXZ2对玉米地下部分重金属含量的影响Fig.3 The effect of FXZ2 on underground parts of maize HMs concentration under multiple-HMs stress

2.2 单一重金属Cd胁迫下内生真菌FXZ2对玉米生长的影响

在单一、不同含量Cd胁迫下，处理组与对照组玉米的生长状况如图5所示。当土壤中Cd含量较高(15和30 mg·kg-1)时，接种FXZ2显著促进了玉米的生长，处理组玉米的根长、鲜重和干重均明显高于对照组(P<0.05)，分别提高了52.15 %、79.74 %、72.01 %(15 mg·kg-1)和66.01 %、41.07 %、45.2 %(30 mg·kg-1)，株高略高于对照组但差异并不显著。在土壤中低含量Cd胁迫下，情况略有不同：在质量分数为0 mg·kg-1时，处理组的株高和根长略高于对照组，鲜重和干重略低于对照组；而在Cd质量分数为5 mg·kg-1时，处理组的鲜重和干重略高于对照组，株高和根长略低于对照组。

图4 复合重金属胁迫下菌株FXZ2对土壤中重金属含量的影响Fig.4 The effect of FXZ2 on soils HMs concentration under multiple-HMs stress

图5 不同含量Cd胁迫下菌株FXZ2对玉米生长的影响Fig.5 The effect of FXZ2 on maize growth under different concentration of Cd stress

在单一、不同含量Cd胁迫下，处理组与对照组玉米叶片中叶绿素含量变化如图6所示。在无Cd胁迫条件下(0 mg·kg-1)，处理组玉米叶片中叶绿素含量明显低于对照组(P< 0.05)，降低了20.6 %；而在较高含量Cd胁迫下(30 mg·kg-1)，处理组玉米叶片中叶绿素含量却明显高于对照组(P<0.05)，提高了12.53 %；而在土壤中Cd质量分数分别为5和15 mg·kg-1时，处理组和对照组玉米叶片中叶绿素含量并无显著差异。此外，随着土壤中重金属Cd含量的增加，处理组玉米叶片中叶绿素含量总体呈上升趋势，而对照组并未发现明显的变化规律。

图6 不同含量Cd胁迫下菌株FXZ2对玉米叶片中叶绿素含量的影响Fig.6 The effect of FXZ2 on maize leaves chlorophyll content under different concentration of Cd stress

3 讨 论

研究发现，无论是在复合重金属还是在单一重金属Cd胁迫下， 接种FXZ2明显促进了玉米的存活和生长。同样，刘茂军[20](2009)也发现在复合重金属或单一重金属Pb、Zn、Cd胁迫下，接种深色有隔内生菌(Dark Septate Endophytic Fungi, DSE)显著促进了玉米的生长。接种该DSE菌株后，玉米根、茎、叶的生物量均明显高于对照。有研究表明，在重金属Cd胁迫下，DSE影响合成细胞壁的相关基因的表达与调控，激活玉米合成细胞壁关键酶的活性，改变细胞壁组分和Cd吸附配位官能团的分布，强化细胞壁对根系吸收的游离Cd离子的固持与区室化作用，从而改变Cd离子在玉米根系组织、细胞和亚细胞水平上的分布，进而限制其向原生质体和地上部分的运输，由此减轻Cd对玉米的毒害[21]。此外，Cd会影响叶绿素酸酷还原酶的活性，从而抑制植物叶绿素合成，叶绿素含量和光合强度随Cd含量的上升而下降，且叶绿素a比叶绿素b对Cd更敏感[22]。玉米叶片中叶绿素含量间接影响到植物的光合作用，研究中发现随着Cd含量增加处理组玉米叶片中叶绿素含量总体呈上升趋势，而内生菌可直接对植物中叶绿素含量产生直接影响[23]。

在复合重金属胁迫下，菌株FXZ2显著影响了玉米各部位对重金属的累积，接种菌株降低了玉米地上部分Zn和Cd的含量，降低了地下部分Cd的含量却提高了Pb和Zn的含量，降低了土壤中Pb和Zn的含量。有报道称，部分真菌可以通过菌丝、泡囊等结构将过量的Pb固定在植物根系，影响植物对Pb的富集特征，显著降低玉米地上部分Pb含量增加根部Pb含量，有效抑制Pb从根部向地上部分的转运，降低Pb对植株地上部分的毒害，减少叶片的自由基积累，维持正常的光合作用[24-25]。此外，真菌与宿主植物形成的共生体可以通过催化合成植物螯合态合成酶( PCs) 螯合细胞质中的重金属离子，并转移至植物液泡来有效提高植物对重金属的耐受性[26]。玉米对Cd具有较强的吸收和积累能力，玉米吸收Cd后主要积累在根部，对Cd胁迫下生长的玉米接种DSE可显著降低玉米对Cd的吸收以及Cd在玉米地上部分和根部含量，产生这种现象的原因可能是DSE对Cd在玉米体内的化学形态和亚细胞分布产生影响，从而提高了玉米对Cd的耐性[27]。内生菌可以通过对重金属离子的吸收和吸附降低植物体内的重金属胁迫强度，部分内生菌可以通过分泌铁载体、有机酸、蛋白质等物质与游离态的重金属离子形成络合物，减少其向植物细胞内转移[15]。

重金属在植物内富集和转运的机制与其在植物体内的吸收机制及生物化学过程密切相关，其中Zn是植物必须的微量元素，植物对Zn以代谢吸收为主，Pb、Cd是植物非必需的元素，Cd是易积累的有毒元素，为被动吸收和代谢吸收，Pb元素为被动吸收[28]。接种菌株FXZ2后，玉米对Pb、Zn、Cd的吸收有所不同，Pb、Zn、Cd在玉米不同部位的含量也存在差异，这可能是FXZ2影响了玉米的某些代谢活动所致。如申蜜[21](2017)研究发现，DSE通过降低玉米根组织中木质部和韧皮部细胞的Cd含量促进Cd在根表皮和皮层细胞的富集，还能显著增加根细胞壁果胶和半纤维1对Cd的富集，减少CW3中Cd含量的比例。土壤性质、重金属离子性质及其赋存形态、以及重金属离子与其他离子产生的协同或拮抗作用，均会影响重金属从土壤向玉米的迁移[29]。所以弄清在Pb、Zn、Cd胁迫下，菌株FXZ2影响玉米生长及Pb、Zn、Cd累积的作用机制，对阐释内生菌增强宿主植物抗重金属抗性以及开发内生菌-植物联合修复重金属污染土壤具有重要意义。

4 结 论

通过盆栽实验发现，重金属耐受内生真菌FXZ2对玉米在不同重金属胁迫下的生长及重金属累积能力产生显著影响：在复合重金属胁迫下，内生真菌FXZ2显著促进了玉米的存活和生长；在单一重金属Cd胁迫下，内生真菌FXZ2促进了玉米在高含量Cd胁迫下的生长。但内生真菌FXZ2对宿主植物产生影响的作用机制还有待研究明确。