穿心莲用于妊娠胆汁淤积症的作用机制

薛莲芳, 刘慧, 丘穗珊, 朱勤爱, 王玉平, 罗惠娟

(暨南大学附属第一医院 1.药学部, 2.临床医学检验中心, 3.产科， 广东 广州 510630)

妊娠期肝内胆汁淤积症(intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP)是妊娠期常见的严重并发症.临床表现为孕妇血清胆汁酸浓度显著增加，伴或不伴转氨酶、胆红素升高[1-2].病因学研究发现该病与遗传和雌激素过高有关，可导致早产、胎儿宫内窘迫和胎死宫内等.目前常用的治疗有腺苷蛋氨酸和熊去氧胆酸，还可以辅助一些利胆退黄的中药，但仍有一部分患者治疗效果不好，需要提前终止妊娠或发生严重胎儿、新生儿并发症.

穿心莲[Andrographispaniculata(Burm. F.)Nees]为爵床科植物，别名一见喜、斩蛇草及苦胆草等[3].其原产于印度半岛和斯里兰卡，在东南亚国家具有悠久的民间用药历史，是最具代表性的“大南药”之一[4].穿心莲性味苦寒，有抗菌消炎、清热解毒及消肿止痛等功效，是清火栀子麦片、消炎利胆片、穿心莲内酯片及莲必治注射液等多种中药制剂的主要原料，可用于呼吸道感染、肠胃炎、高血压、疟疾、毒蛇咬伤、糖尿病及高血压等疾病的临床治疗，有“中药抗生素”之称[5-6].穿心莲主要药用成分为烷型二萜类化合物，如穿心莲内酯(andrographolide，AD)、新穿心莲内酯(neoandrographolide，NAD)、14-脱氧穿心莲内酯(14-deoxyandrographolide，14DAP)及脱水穿心莲内酯(dehydroandrographolide，DDAD)等[7].

本文通过网络药理学方法首次对穿心莲治疗ICP的分子机制进行了全面系统的解析，网络药理学方法可通过整合多种生物数据库，构建“成分-疾病-靶点-通路”的互作网络，探究中药成分对于疾病的主要分子作用机制与信号通路，是目前探索中药方剂药理机制的综合有效的方法.另外，本研究通过建立ICP大鼠动物模型，给予模型鼠AD治疗，观察AD对ICP的治疗效果，进一步阐述穿心莲治疗ICP的分子机制，探究其对关键靶点的作用，为临床药物的开发和临床应用提供依据.

1 材料与方法

1.1 穿心莲化学成分及其靶点的预测

以“穿心莲”为关键词，通过中药系统药理学数据库(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)进行检索，得到穿心莲的主要化学成分.根据药物筛选中最常用的两种药代动力学特性进行筛选：口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，类药性(drug-like，DL)≥0.18，从而获得穿心莲中具有较高活性的潜在有效化学成分.

1.2 靶点的筛选

GeneCards (https://www.genecards.org/)是一个集成大量web源的以基因为中心的数据库，能解释并预测人类基因信息.以妊娠期肝内胆汁淤积症“Intrahepatic cholestasis of pregnancy”为关键词，在GeneCards数据库查找疾病相关靶点.通过Comparative Toxicogenomics Database(http://ctd.mdibl.org/)数据库中MyVeny功能，绘制穿心莲成分靶点与疾病靶点匹配映射的韦恩图，获得穿心莲治疗ICP的潜在靶点.

1.3 PPI图制作

将药物作用靶点和疾病靶点的交集输入到STRING数据库，种属选择“Homo sapiens”，获取公共靶点的相互作用网络图(PPI)，并进行拓扑学分析，导出string.interactions.tsv文件.

1.4 功能和通路富集分析

利用Bioconductor平台和R语言对获得的基因进行基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析.首先进行R 语言安装包的安装，包括DOSE，clusterProfiler，enrichplot，colorspace，stringi，ggplot2，pathview软件包，分别导出GO 功能富集分析和KEGG通路富集分析表格，将分析结果的前20 条进行可视化.

1.5 试剂与仪器

SD大鼠购自南方医科大学实验动物中心[许可证号：SYXK(粤)2017-0125]；苯甲酸雌二醇(批号K1617016)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；大豆油(批号D1515001)购自aladdin公司(批号D1515001)；氯化钠注射液(批号1907172727)购自辰欣药业有限公司；促凝管(批号190309)购自浏阳市三力医药科技有限公司，离心机(TDL- 40B)购自上海安亭科学仪器厂(TDL- 40B)，全自动生化分析仪(型号7600)购自日立公司.

1.6 动物实验

SD大鼠雌性70只，雄性35只，体质量(220.3±13.5)g,自由饮水与饲料，发情期雌性和雄性大鼠按2∶1合笼.交配后以阴道拭子见精子即妊娠第0天为标准判断妊娠成功，选取其中50只成功受孕雌鼠实验.妊娠后第10天，随机将50只雌鼠分5组(空白组，模型对照组和高、中、低剂量治疗组)，每组10只.根据文献[8]对模型对照组和治疗组进行造模.常规喂养至妊娠第10天，除空白对照组外，其他各组自大鼠颈背部皮下注射质量分数3 mg/kg苯甲酸雌二醇. 取适量穿心莲内脂溶解于大豆油中配置质量浓度5 mg/mL的备用药液，治疗组大鼠按照体质量计算给药体积后每天分别灌胃穿心莲内脂溶液(高剂量组80 mg/kg，中剂量组40 mg/kg，低剂量组20 mg/kg).模型组灌胃氯化钠注射液2 mL；妊娠第17天，大鼠乙醚麻醉，腹主动脉取血3～5 mL，置于促凝管中，3 000 r/min离心10 min，取上清液，交检验科测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)，谷草转氨酶谷草转氨酶(AST)，总胆汁酸(TBA)，胆红素(TBIL)水平[1-2].孕鼠取血后，取胎，记录活胎鼠数，死胎数量，胎鼠体质量.

2 结果

2.1 穿心莲候选化合物及靶点筛选

在TCMSP 数据库中，检索中药“穿心莲”得到化学成分49个，以OB≥30%、DL≥0.18 为条件，筛选出穿心莲潜在活性化合物24个，主要包括穿心莲黄酮、穿心莲内酯、汉黄芩素和穿心莲黄酮甙 F、14-去氧-12-甲氧基穿心莲内酯等组分(表1)，共预测靶标65个.

表1 穿心莲的活性成分及参数Table 1 The active ingredients of Andrographis paniculata

2.2 药物与疾病相交的靶点

通过Gene Cards数据库共检索出984个疾病相关靶点.将穿心莲潜在作用靶点映射到获得的疾病相关靶点中，共获得30个相交靶点，制成韦恩图(图1).从侧面佐证了穿心莲治疗该疾病的科学性和有效性.

2.3 “药物-成分-疾病-靶点”网络模型的构建及分析

将穿心莲的24个活性成分与30个药物-疾病共同靶点输入Cytoscape 3.7.1 软件中，构建“药物-成分-疾病-靶点”相互作用网络图(图2).结果涉及21个成分(3个活性成分靶点与疾病靶点无交集，故删除)和30个药物-疾病共同靶点，充分体现了穿心莲多成分、多靶点治疗ICP的作用.

图1 韦恩图

图2 有效成分-靶点网络图

2.4 PPI网络构建

将30个靶蛋白输入到STRING数据库获得PPI网络图(图3).该网络共有30个节点，共185个相互作用关系线，平均度值为12.3.

图3 PPI网络图

2.5 靶点功能及通路富集分析

基于穿心莲治疗ICP交集网络共筛选到30个靶点基因进行富集分析，根据P值，排前20的显著富集GO 功能和KEGG 代谢通路如图4.其中GO 富集分析涉及生物学过程(biological process)、分子功能(molecularfunction) 和细胞组成(cellular component) 等3个水平.共同作用靶点在生物过程(BP)中，主要富集条目多为对类固醇激素的反应、DNA模板化的转录起始、氧化应激反应(图4).共同作用的靶点在细胞组成(CC)中主要富集条目为周期蛋白依赖蛋白激酶全酶复合物、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物、蛋白激酶复杂(图5).共同靶点在分子功能(MF)中主要富集的条目为类固醇激素受体活性、核受体活性、转录因子的活性, 泛素蛋白连接酶结合(图6).KEGG 富集分析结果显示如图7所示，共同靶点主要富集于PI3K-Akt信号通路、小细胞肺癌通路、乙型肝炎通路.

图4 生物学过程图

2.6 实验验证

2.6.1 各组孕鼠体内血液生化指标比较

血清标本经血液生化分析仪检测TBIL，ALT，AST，TBA值见表2.与空白对照组比较，其他各组生化指标均显著增高(P<0.05)，显示苯甲酸雌二醇造模效果好、成功率高.除低剂量组，其他各组与模型对照组比较各指标均有显著性差异(P<0.05)，中、高剂量治疗组各项指标与模型对照组比较均明显下降(P<0.05)，高剂量组改善尤其明显.

图6 分子功能图

图7 KEGG图

表2 各组孕鼠体内血液生化指标比较Table 2 Comparison of blood biochemical indexes in pregnant rats of each group

2.6.2 各组胎鼠数量与质量比较

空白组胎鼠全部存活，无死胎，平均质量最大，各项指标均明显优于其他各组.低剂量组在各项指标上与模型组均无显著差异.观察活胎鼠数，高剂量组比中、低、模型对照组均具有显著提高，中剂量组在这个指标上对比低、模型组又有明显改善.观察死胎数量，中、低、模型组3组间无显著差异，高剂量组死胎数量明显高于其他各组.观察胎鼠平均质量，高剂量组质量明显大于中、低、模型对照组，而中剂量组对比低、模型组又有明显提高.

表3 各组胎鼠数量与质量比较Table 3 Quantity and quality of fetal rats in each group were compared

3 讨论

目前ICP的发病机制尚不明确，可能与多种因素有关，其中高激素水平是导致ICP发生的重要原因之一.研究显示雌激素在ICP 的发病过程中风险系数较高，起着重要的作用，ICP孕妇体内的雌激素水平如果快速提升可引起肝细胞酶水平异常，这会降低胆盐的代谢能力，从而诱发瘙痒、黄疸、尿酸高等症状[9-10].本次实验根据文献使用苯甲酸雌二醇成功诱导孕鼠ICP发生，孕鼠体内血液生化指标均显著高于空白对照组，显示该造模效果明显，成功率高.ICP治疗常用的药物有腺苷蛋氨酸和熊去氧胆酸[11]，可以辅助一些利胆退黄的中药，但仍有一部分患者无效或病情反复，需要提前终止妊娠或发生胎儿、新生儿严重并发症.

利用纯天然植物或动物中提取的有效成分诊治疾病，已成为现代医学的发展热点.爵床科植物穿心莲应用于炎症相关性疾病已有上百年历史，明确、安全、有效的治疗效果使其受到广泛关注，随着对穿心莲的研究深入，它所显现的广泛的生理活性及防治心血管疾病、抗肿瘤、保肝利胆、增强免疫等多重功效, 使其成为一种很有前途的中药, 值得进一步研究和开发.近十几年的研究发现，AD对于重症感染、酒精、有毒化合物导致的肝损伤均有明显的治疗作用[12-14].对胆汁淤积诱导肝纤维化具有保护作用[15]，AD可以有效地降低胆汁酸水平，增加实验大鼠、豚鼠的胆汁流量、胆盐、胆酸和去氧胆酸量，改善肝功能[16]，与其他降胆酸的药物不同的是，AD还有抗病毒的作用[17-18]，这对于大量合并乙肝病毒携带的ICP患者无疑是一个可能更好的选择.

本实验结果表明，高、中剂量治疗组使用AD后对TBIL，ALT,AST,TBA值均有一定改善作用，且高剂量组对TBA值降低作用十分明显，说明穿心莲内酯对ICP具有治疗作用，且呈现剂量依赖关系.低剂量治疗组对ICP未显示明显治疗作用，说明本实验使用的高、中剂量组的穿心莲内酯虽对ICP有明显疗效，但未能完全消除ICP过程中TBA值的上升现象，可能需要增加药量或延长疗程.除TBA外，ALT， AST，TBIL 3个指标也是ICP患者常见的异常指标[19]，本研究中该3个生化指标也根据实验条件变化而发生相应改变，模型组在苯甲酸雌二醇的刺激下3个指标均大幅增长，但可以被高、中剂量AD缓解.穿心莲内脂对胆汁酸和肝功能的改善效果说明其对ICP具有一定的治疗潜能.

ICP发生时会导致血清胆汁酸水平增加并通过胎盘运输到胎儿，导致胎儿受到严重损伤.此时因为孕妇自身胆酸水平显著升高，胎盘绒毛膜间隙受此作用会显著缩小，导致流入胎盘中的血流量降低，影响胎盘正常血液灌注.再加上胆酸的血管收缩作用，所以围产期胎儿很容易缺血缺氧，发生窘迫或死胎[20-21].本研究发现模型组胎鼠数量与体质量均显著低于空白对照组，说明胎鼠受到母体ICP影响，数量与体质量均下降.给药后发现高、中剂量治疗组在胎鼠数量与质量方面均有一定改善，且死胎数量也少于模型组与低剂量治疗组，但与空白组比还有一定差距.说明实验剂量的AGL在一定程度上可以缓解ICP，但没有完全改善不良预后.此外，虽然高剂量组在死胎数量上明显高于其他各组，但活胎数也明显多于模型对照组和中、低剂量治疗组，因此高剂量治疗组的胎儿死亡率(36.59%)仍然低于中剂量组(39.56%).

AD在妊娠期使用的安全性存在争议，使它在临床上的使用受到限制.既往报道，中药穿心莲具有明显抗早孕效果.动物实验中显示对不同妊娠期的小鼠都有明显的终止妊娠作用，作用机理与抗孕酮抵抗有关，因此认为外源性孕酮有明显的防止穿心莲早期流产的作用[22].有学者研究穿心莲提取物对大鼠血孕酮水平的影响，在怀孕的第19天给予200、600和2 000 mg/kg的剂量，发现对大鼠血浆中孕酮水平的升高没有任何影响.因此认为在有效治疗剂量下，穿心莲提取物不会诱导孕酮介导的终止妊娠[23].研究还发现AD还能抑制子宫腺肌症患者子宫肌层的催产素受体(OTR)的表达，从而抑制子宫收缩，达到止痛目的[24-25]，因此AD在晚孕期使用的安全性目前还没有确定.本实验发现，模型对照组死胎率最高，治疗组死胎率都有不同程度的下降，尤其高剂量治疗组，可见AD在孕晚期大鼠的使用并未增加死胎的发生，可能由于血清胆汁酸水平仍未恢复正常，所以还会导致一些胎鼠的死亡.

综上所述，AD对ICP大鼠模型具有一定治疗效果，对血液生化指标有明显改善作用，对胎鼠的数量和质量均具有一定保护作用，值得进一步研究，具有一定临床应用可能.