一种新型体外溶血检测技术的建立及应用

蒋群芳， 张崇林， 秦益民， 吴革成， 李奇

(桂林市妇女儿童医院 检验科， 广西 桂林 541001)

目前我国红细胞的同型输注，主要针对ABO和RhD血型，仅有为数不多的医院开展Rh血型系统(C、c、D、E、e)同型输血，除此之外还有41个血型系统尚未检测.在对献血者和受血者常规进行ABO、RhD表型鉴定、不规则抗体筛查同时，还应积极检测其他具有临床意义的血型系统，如MNS、P、Rh、Lutheran、Duffy、Kidd及Diego等[1-2].尤其是有反复输血史的患者，在首次输血会刺激机体产生同种抗体与红细胞表面抗原结合发生溶血以清除抗原，随后抗体水平下降维持在低水平，而现有的检测手段很难检测其存在.但当含有相同血型抗原的红细胞再次输注后，免疫系统会快速响应并分泌大量的抗体以清除体内抗原，即二次免疫应答[3-4]，患者发生溶血性输血反应，出现发热、贫血、黄疸和血红蛋白尿等症状，严重时甚至危及生命[2-3].为解决这一棘手问题，亟需建立一项灵敏度高、检测范围广、特异性强且便于普及的溶血检测技术，为此本研究将不规则抗体检测试验和胶体金法检测血红蛋白结合在一起，建立一种新型体外溶血检测技术，现概述如下.

1 材料和方法

1.1 材料

收集2018年3月至2020年2月我院不规则抗体筛查阳性的血清学标本33例，排除检测前已发生溶血或存有红细胞脆性病人(如遗传性球形红细胞增多症、自身免疫性溶血性贫血及阵发性睡眠性血红蛋白尿等疾病)样本，通过抗体鉴定明确其抗体类型后保存至-20 ℃以下备用.抗体筛查红细胞购自上海血液生物医药有限责任公司，胶体金检测试纸条购自北京瑞尔达生物科技有限公司.

1.2 方法

1.2.1 AB型标准新鲜冰冻血浆的制备

将筛检红细胞或谱红细胞配制体积浓度为0.5%～0.8%红细胞悬液，取50 μL加入微柱凝胶卡各孔中，分别加入被检血清1滴(50 μL)，加样后将其置于37 ℃孵育器中孵育15 min；孵育结束后离心(900 r/min离心2 min，1 500 r/min离心3 min)，取出凝胶卡肉眼观察并判读结果，所有被检红细胞沉于微柱凝胶的底部为阴性，反应结果阴性的血浆为合格.取上述检测阴性的血浆50 μL，加入1.95 mL PBS后，将胶体金试纸条插入其中，5 min后观察并读取实验结果，胶体金试纸条阴性为合格.

1.2.2 抗原嵌和红细胞悬液制备

包括两种RhD阳性细胞(CCDee、Cw+和ccDEE)和一种RhD阴性细胞(ccdee)、双倍剂量的Fya、Fyb、Jka、Jkb、M、S和s，以及至少一种对K、Lea、Leb、P1、N、Mia、和Dia呈阳性的细胞.然后各取一份上述红细胞悬液按照体积比1∶1∶1的比例加于试管中混匀，PBS离心洗涤3次后，取最后1次洗涤的PBS溶液，将隐血试纸条置于其中，5 min后观察并读取结果，胶体金试纸条阴性为合格.

1.2.3 反应体系稀释倍数的选择

胶体金试纸条的敏感范围在1～625 mg/L[5-6]，正常人血浆中游离血红蛋白质量浓度<40 mg/L(邻-甲联苯胺法)，若整个反应体系直接用血浆稀释会增加实验的假阳性,因此需要将血浆适当稀释.取40例正常人血浆分别作1∶5、1∶10、1∶20、1∶40及1∶80稀释，将隐血试纸条置于其中5 min后观察，实验结果的假阳性率分别为17.50%(7/40)、7.50%(3/40)、2.5%(1/40)、0(0/40)、0(0/40)，选取40倍稀释为最佳稀释倍数.

1.2.4 单个核细胞的分离

取0.5 mL Ficoll移入1.5 mL 的EP管中，用移液枪吸取1.0 mL抗凝外周血，缓缓叠加至Ficoll上层，室温下2 000 r/min离心20 min后小心打开EP管盖子，取单个核细胞层用PBS洗涤3次，然后用患者血浆将其重悬，备用.

1.2.5 溶血结果的检测与判读

分别取体积浓度为0.5%～0.8%的指示红细胞悬液100 μL加入1号和2号EP管中，随后加入上述待检细胞悬液100 μL.(1)直接法：将1号管轻轻振荡混匀后置于25 ℃孵育1 h，孵育结束后用PBS洗涤3次，然后加入AB型标准新鲜冰冻血浆(含有补体系统的所有有效组分)200 μL，置于37 ℃孵育4 h，孵育结束后取50 μL上述悬液加入1.95 mL PBS中，混匀后将隐血试纸条插入其中，5 min后观察并读取结果.(2)间接法：将2号EP管轻轻振荡混匀后置于37 ℃孵育1 h，孵育结束后用PBS洗涤3次，依次加入1滴Coombs试剂和200 μL AB型标准新鲜冰冻血浆振荡混匀后继续置于37 ℃孵育4 h，孵育结束后取50 μL上述悬液加入1.95 mL PBS中，混匀后将隐血试纸条插入其中，5 min后观察并读取结果，检测原理如图1所示.

结果判读如下：(1)1号和2号管阴性：患者体内不含有同种抗体和自身抗体.(2)1号管阳性，2号管阴性：患者体内含有可导致供者红细胞溶血的IgM型同种抗体或自身抗体.(3)1号管阴性，2号管阳性：患者体内含有可导致供者红细胞溶血的IgG型同种抗体或自身抗体.(4)1号和2号管均阳性：患者体内含有可导致供者红细胞溶血的IgM型和IgG型混合同种抗体或自身抗体.

1.3 统计学方法

利用SPSS 19.0非参数检测(Mann-Whitney Test)对数据进行统计分析，以P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 不同性质不规则抗体(IgG/IgM型)的检测

通过对正常人血浆不同反应强度的IgG型不规则抗体检测分析，发现当IgG型抗红细胞抗原抗体的反应强度在+/-至4+时，新型体外溶血技术均可有效检出抗体存在；其他两种方法中凝胶卡法可检出IgG型抗体，盐水法均未检出IgG抗体；上述3种方法阴性质控均为阴性.当IgM型抗红细胞抗原抗体的反应强度在+/-至4+时，该技术均可有效检出抗体存在；其他两种方法中盐水法均可检出IgM抗体，当IgM型抗体的反应强度在+/-至2+时，凝胶卡法检出效果较差，当IgM型抗体的反应强度在3+至4+时，凝胶卡法检测结果仅为1+至2+，与盐水法不匹配；上述3种方法阴性质控均为阴性.故新型溶血技术对不同性质不规则抗体(IgG/IgM型)检测率高于盐水法和凝胶法.具体结果如表1.

表1 IgG/IgM型抗体在不同检测方法下反应强度1) (n≥3)Table 1 The reaction intensity of IgG/IgM antibody in different detection methods (n≥3)

2.2 不同种类不规则抗体的检测

通过对20种抗红细胞抗体检测分析，发现该技术比盐水法和凝胶卡法具有优势，不受抗体种类影响，可有效检出各种不同种类的不规则抗体，如 Rh、MNSs、Duffy、Kidd、Lewis及JMH系统和自身抗体，详见表2.

表2 新型体外溶血检测技术对不同种类型不规则抗体的检测

2.4 3种方法检测结果比较

新型溶血技术、盐水法及凝胶卡法同时对33例不同种类、不同性质的自身抗体或同种抗体检测，结果显示3种检测方法检测出阳性分别为33例、6例、29例.在抗体筛查方面，新型溶血技术较盐水法具有更高的检出率(Z=-6.708，P<0.01)；与凝胶卡法相比，亦具有更高的检出率(Z=-2.048，P<0.05).结果见表3.

表3 3种方法不同检测结果比较Table 3 The comparison by three methods

3 讨论

目前我国输血人群中红细胞抗体出现频率较高，为2%左右，以Rh系统最为常见，占74.3%以上，其次为Lewis、MNSs及Kidd等血型系统，分别占8.5%、3.9%和1.0%左右[7].其原因是我国红细胞的同型输注，仅针对ABO和RhD血型.欧洲早在2004年就已经建立了完善的输血免疫检测体系，对输血前后的全过程进行精准监控和风险评估，2005～2009年每年输血后发生同种免疫比例明显降低，每输注100 000单位血液产生新抗体的病例仅为0.59例[7-8].因此建立完善的输血检测体系，降低同种抗体产生的溶血性输血反应势在必行.溶血性输血反应是由于患者体内血型抗体致敏输入的红细胞导致破坏，如红细胞的破坏由IgM型抗体和补体引起，红细胞膜上的血型抗原被抗体致敏后，可固定并激活补体连锁反应，最后形成膜攻击复合物并穿透红细胞膜，进而导致红细胞血管内溶血[9-10].IgG抗体与IgM不同，致敏红细胞后部分激活补体反至C3b阶段，被IgG抗体或补体片段C3b致敏后，被网状内皮系统的单核-巨噬细胞吞噬破坏，从循环中清除消失[11-12]，故借助胶体金法高敏感性特点检测反应体系中溶血后的血红蛋白，建立一种新型体外溶血检测技术.

本研究与传统方法不同，不仅仅局限于血浆中不规则抗体的检测，还包括活化的B淋巴转化为浆细胞再次接触相同抗原刺激时产生大量的抗体，因此以患者体内活化后的单个核细胞(富含活化的淋巴细胞和浆细胞)及血浆共同作为待检样品，充分模拟体内溶血的过程.具体优点如下：(1)首次开发设计模拟体内溶血的检测试剂盒，以往大部分试剂盒主要用于检测是否有体外凝集，而对体外溶血的检测力度不够.(2)检测范围广，该试剂盒可用于检测抗A抗体和抗B抗体以外针对所有血型抗原的IgG和IgM类不规则抗体(如抗-D、抗-C、抗-E、抗-c、抗-e、抗-K、抗-k、抗-JKa、抗-JKb、抗-Fya、抗-Fyb、抗-Lea、抗-Leb、抗-M、抗-N、抗-S、抗-s、抗-P、抗-Mia、抗-Dia等).(3)灵敏度高，胶体金试纸条或Hb蛋白质量浓度检测可检测质量浓度低至1 μg/mL的血红蛋白，提高了检测敏感性.(4)检测特异性强，抗原抗体反应的高度专一性决定了该检测技术具有高度特异性[6，8].(5)可用于抗体类型的鉴定，直接法检测到的溶血为IgM型抗体所致，其他类型的抗体由于溶血效应较低，不能直接检测；间接法，即在IgG型抗体致敏RBC后再加入抗Ig二抗，使抗血细胞抗原抗体IgG与抗Ig抗体结合成复合物，此时便可活化补体导致溶血.(6)该技术的建立有效降低免疫抗体的产生及溶血性输血反应的发生，尤其有益于地中海贫血、再生障碍性贫血等需要反复输血，甚至终身输血患者的长期生存.

综上所述，本研究将体外不规则抗体检测试验和胶体金法检测血红蛋白结合起来，以患者体内活化后的单个核细胞及血浆共同作为待检样品，充分模拟体内溶血过程，成功建立了一种新型体外溶血检测技术，可有效检出各种类型的不规则抗体，避免反复输血患者的溶血性输血反应.