冬季高山草甸土壤微生物数量和活性对短期碳输入的响应

胡霞, 尹鹏, 刘忠, 黄娇, 彭言劼, 范晶*

(1. 乐山师范学院 生命科学学院, 四川 乐山 614000； 2.中国科学院成都生物研究所 中国科学院山地生态恢复与生物资源利用重点实验室， 四川 成都 610000)

土壤微生物是陆地生物地球化学循环的主要驱动者，直接参与土壤有机质分解、转化、积累和养分循环等关键生态过程，对生态系统生产力维持起着重要的作用[1-4].多年来，人们都主观认为在氮循环过程中起着重要作用的微生物在寒冷的冬季处于睡眠状态，然而在北极地区的研究表明，冷季的土壤仍然维持着微生物的活动，甚至土壤冻结的时候，北极地区的土壤中微生物活动仍然继续[5].然而，微生物的数量和活动随着温度下降而快速减少[6].北极冻原地区的研究发现，冬季微生物活性减少主要归因于整个冬季碳供应不足导致的碳亏缺[7]. 而对于低纬度、高海拔、有机质丰富、冬季土壤冻融交替变化频繁的青藏高原东部地区是否存在碳亏缺有待进一步的探究.目前，国内外关于外源碳输入和冻融事件对土壤生态系统过程影响的报道很少，尤其缺乏在青藏高原地区冬季土壤微生物组成和功能的研究.

本文通过研究青藏高原东部高山草甸土壤微生物数量和活性对外源短期碳添加和冻融循环的响应机制，试图回答“在有机质丰富且冻融频繁的青藏高原地区，碳限制是否影响微生物数量和活性”的科学问题，旨在多尺度多区域的了解高山土壤生态过程，并为进一步研究冬季高山土壤微生物菌群的转化和微生物生物量碳氮的养分释放提供理论依据.

1 材料和方法

1.1 实验样地

研究地点位于四川省阿坝州松潘县章腊乡卡卡山的中科院成都生物所生态站实验基地(32°59′N, 103°40′E, 海拔3 500 m).年均温2.8 ℃，一月均温-7.6 ℃，每年11月底或12月初出现持续的积雪覆盖.土壤为棕色草毡土(pH 5.42～5.83,土壤有机质SOM 44.23～62.00 g/kg, 总氮TN 3.51～5.12 g/kg)，平均土层厚度约为63 cm，植物根系主要分布于2～20 cm深的土层.

1.2 实验设计

在实验基地内设置5个3 m×5 m的样地，用原位PVC管采用对角线法取足够的土壤.带回实验室后移去可见的杂质和植物根后，将土壤混合均匀，调节含水率为70%，在25 ℃恒温下稳定1周后将土壤装入45个塑料培养盒中(每盒装入250 g).再将45个培养盒分成5组，每组分别加入不同浓度的葡萄糖溶液，得到4个碳浓度梯度和1个对照组，分别为0 mg/g (CK)、 1 mg/g(C1)、2 mg/g(C2)、4 mg/g(C3)和8 mg/g(C4).然后将每个碳浓度梯度组的土样再随机划分为3个温度处理亚组(5次重复).按照Sulkava(2003)的方法分别进行3个温度梯度模拟实验(大幅度冻融-20 ℃～2 ℃， 小幅度冻融-2～2 ℃，持续低温冻结-2 ℃).培养结束后测试土壤内微生物生物量，微生物数量和土壤酶活性.

1.3 测试方法

稀释平板计数法测定土壤细菌和真菌数量；氯仿熏蒸-浸提法测定微生物生物量碳(MBC)和微生物生物量氮(MBN)的质量分数；3, 5-二硝基水杨酸比色法测定土壤蔗糖酶活性；高锰酸钾滴定法测定土壤过氧化氢酶活性；茚三酮比色法测定土壤蛋白酶活性[8].

1.4 统计分析

数据采用Microsoft Excel 2017进行处理，用SPSS 13.0进行双因素方差分析(ANOVA)，最小显著差异法(LSD)比较组间差异，显著性水平设为α=0.05.Excel 2017软件绘制折线图.

2 结果和分析

2.1 土壤微生物数量

土壤中的细菌数量和真菌数量随着短期外源碳添加的增加而逐渐增加，尤其大量的碳输入时(C3，C4)尤为明显(图1).C4组土壤细菌数量增加到了对照的1.19～4.27倍，土壤真菌数量增长更为明显，达到了对照组的7.23～22.27倍之多.直观上看，大量碳输入时土壤冻融增加了细菌数量，而小幅度冻融增加了真菌数量.短期碳输入极显著增加了细菌和真菌数量(P<0.01)，小幅度冻融显著增加了真菌数量(P<0.05)，而冻融交替对细菌数量无统计学上的影响(P>0.05).碳输入和冻融交替的交互效应对细菌数量的影响也极其显著(P<0.01)，表现为当大幅度冻融时，C4组极显著的大于其他碳添加处理.

2.2 土壤微生物生物量碳氮质量分数

与微生物数量变化趋势一致，MBC和MBN质量分数也随着短期外源碳输入的增加而逐渐增加(图2).与对照组相比，C4组MBC和MBN分别增加了30.90%～58.13%和45.04%～137.71%.短期碳输入极显著的增加了MBC和MBN质量分数(P<0.01)，而冻融交替和两者的交互作用均无统计学差异(P>0.05).

1)同一冻融处理下，碳输入处理组与对照组相比，P<0.05. 2)同一碳处理下，与持续冻结相比，P<0.05.

微生物生物量碳氮比(wMBC/wMBN)则随着外源碳输入的增加而呈现逐渐降低的趋势(图2).C4组的wMBC/wMBN比对照组降低了19.98%～47.18%(P<0.01).大幅度的冻融显著降低了wMBC/wMBN(P<0.05)，比持续低温冻结和小幅度冻融分别降低了5.53%～25.27%和4.47%～36.94%.

2.3 土壤酶活性

土壤过氧化氢酶和纤维素酶活性在不同的冻融条件下表现出较一致的变化趋势(图3)，具体表现为小幅度冻融交替时酶活性最高，显著高于持续低温冻结和大幅度冻融交替时的酶活性(P<0.05).而土壤蔗糖酶活性则表现出不同的变化规律，其酶活性在持续的低温冻结时明显增加，而大幅度的冻融交替时则显著降低(P<0.01).

短期外源碳输入对不同的3种土壤酶活性呈现不同的规律.过氧化氢酶活性无规律性的影响，却显著提高了纤维素酶和蔗糖酶活性(P<0.05)，大量外源碳输入时尤为明显.C4组纤维素酶活性比对照组增加了59.13%～62.33%，蔗糖酶活性比对照组增加了38.63%～169.23%.同时，冻融交替和外源碳输入的交互作用对蔗糖酶的影响显著(P<0.05)，具体表现为在持续低温冻结C4组蔗糖酶活性显著高于其他碳输入水平的酶活.

1)同一冻融处理下，碳输入处理组与对照组相比，P<0.05. 2)同一碳处理下，与持续冻结相比，P<0.05.

1)同一冻融处理下，碳输入处理组与对照组相比，P<0.05. 2)同一碳处理下，与持续冻结相比，P<0.05.

3 讨论

植物凋落物的输入和土壤碳源的输入可以引起土壤碳库和养分库的动态变化，进而影响土壤微生物群落和活性[9-13].之前的研究说明，土壤食物链和微生物活性是被能量限制的，土壤中大量营养元素和微量营养元素的流动是和可利用碳相联系的[14].然而，以往关于增加植物碳输入能否改变微生物群落结构和活性的研究仍然存在一些争议.例如，Nadelhoffer等的研究发现，地上施加有机碳源5年后并未引起土壤细菌或真菌生物量的任何变化[15].也有研究表明，连续2～6年施加碳源后，土壤酶活性也没有显著变化[16].本研究结果与之前大多数的结论一致[17-20]，短期外源碳的添加显著增加了细菌和真菌数量，微生物生物量碳氮质量分数，以及纤维素酶和蔗糖酶活性，说明微生物生长和活性的潜在限制作用被减轻或消除了，对土壤真菌而言尤为如此.冬季真菌对碳的需求量是细菌的3倍，因而更容易受到有效碳的限制[14]，外源大量碳的输入导致真菌数量急剧增加，明显减轻或消除了真菌营养限制的影响.究其原因，也有可能是不同微生物群落在对新输入有机质的利用存在竞争机制，而真菌群落的生长策略使其具有更强的激发效应[21].

土壤季节性冻融是在表土以下的一定深度形成的反复冻结和解冻的过程，是普遍存在于高海拔地区的一种重要现象[22-23].冻融可以改变土壤的物理、化学和生物性质，其频率、速度和温度变化范围对土壤微生物状况有很大的影响.不少学者对土壤冻融期间微生物活性、数量、群落结构等方面开展了研究.结果表明，冻融会改变土壤结构，杀死大量土壤微生物，导致微生物活性下降或死亡，降低土壤微生物MBN质量分数[23-26].由于不同生态系统中微生物对于温度和环境的耐受度不同，因而也有研究得出了不同的结果.王楠等[27]在黑龙江帽儿山的研究表明，昼夜冻融导致土壤微生物群落结构发生改变，具体表现为真菌相对丰度明显减小，细菌相对丰度则呈增大趋势.而在川西高原岷江地区的研究发现[28]，温和的冻融事件会破坏土壤团聚体结构，促进土壤毛细管中的溶解态碳氮养分被固定，并促进土壤有机质和有效养分的释放，因而更有利用于微生物数量和活性的增长.王怀玉等[29]对川西亚高山森林土壤微生物群落的研究也证实，在季节性土壤冻结过程中真菌数量显著增加.本研究也支持这个结论，虽然变温幅度较大的冻融显著降低微生物的数量和活性，但小幅度的冻融交替显著增加了真菌数量，过氧化氢酶和纤维素酶的活性.可能有以下几方面的原因：①变温范围大的冻融，其冻结后的最终温度很可能低于微生物细胞的可耐受临界温度，冻结产生的冰晶体膨胀对真菌细胞膜造成严重的机械损伤，导致可培养真菌数量减少[30].②变温幅度大的冻融交替在土壤剧烈冻结时段其自由水含量已经远远不能满足微生物活动所需，致使大量冷敏感菌死亡或休眠，而在土壤融化时段土壤水分快速增加又使微生物在短时间内处于厌氧环境中，导致微生物活力的下降和总体数量的减少[27, 31-32].③变温幅度小的冻融使土壤自由水含量增加，土壤中的有效养分得到释放和转运，刺激了真菌的快速生长和繁殖，同时真菌菌丝体能够利用土壤颗粒周围吸附的自由水以保持自身生理代谢活性，致使小幅度冻融下土壤真菌数量显著增大[30].④变温幅度小的冻融使土壤团聚体被适度破坏，被固定在土壤中的有效底物及破碎的土壤团粒、植物根系、凋落物和死亡的微生物释放出大量的营养物质，从而激活了土壤酶活性[23].

4 结论

短期外源碳输入显著增加了微生物数量，微生物生物量，土壤纤维素酶和蔗糖酶的活性，表明青藏高原东部冬季高寒土壤微生物的碳限制作用随着外源碳的输入而减轻或消除.大幅度的冻融交替显著降低了蔗糖酶活性，而小幅度温和的冻融交替却显著增加了真菌数量，过氧化氢酶和纤维素酶的活性，说明冬季高寒地区适度温和的冻融对微生物有利，并进一步对土壤养分的转化有积极参加作用.