基于肿瘤浸润免疫细胞的弥漫性大B细胞淋巴瘤预后模型的构建及初步评价*

喻经纬 孟祥睿 郎鸣晓 周世勇 张会来

淋巴瘤是一种起源于淋巴造血系统的恶性肿瘤，主要分为霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤两大类，绝大部分淋巴瘤属于非霍奇金淋巴瘤［1］。弥漫性大B 细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是最常见的非霍奇金淋巴瘤类型，约占新发病例的30%～40%［2］。R-CHOP（利妥昔单抗、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松）是DLBCL的主要治疗方案，然而由各种因素导致的原发和继发性耐药是患者预后不佳的重要原因之一［3-4］。筛选有效且方便适用的DLBCL 预测标记物或预测模型来辅助临床决策，对于患者的个体化和精准化治疗及改善患者的预后具有重要价值。

肿瘤浸润免疫细胞与乳腺癌［5］、肺癌［6］、结直肠癌［7-8］等肿瘤患者的预后密切相关［9］。近期研究表明［10］，CD25+FOXP3+淋巴细胞浸润与DLBCL 患者预后呈正相关，而肿瘤细胞程序性死亡-配体1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）高表达伴低PD-1+或CD8+肿瘤浸润淋巴细胞的DLBCL 患者预后较差［11］。此外，基于肿瘤浸润免疫细胞的多细胞预测模型也表现出良好的预后效果［12］。

本研究基于ImmuCellAI算法对来自GEO数据库的412 例DLBCL 患者全基因组表达谱数据进行了处理，得到24 种免疫细胞在DLBCL 组织中的丰度信息，并预测各个患者对免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICPIs）的反应性。通过生存分析、ROC 曲线、列线图以及临床决策曲线（decision curve analysis，DCA）等一系列研究方法建立并初步评价基于免疫细胞模型的预后价值，并探讨免疫细胞模型在ICPIs疗效预测中的应用前景。

1 材料与方法

1.1 病例资料

414 例具有匹配临床信息的DLBCL 患者全基因组表达谱数据下载于GEO 数据库，数据存储号：GSE10846。临床信息包括年龄（14～92岁）、性别、发病部位、分子亚型（ABC、GCB及未分类亚型）、总生存时间（overall survival，OS）、生存状态、化疗方案（CHOP 方案和R-CHOP 方案）、ECOG 体力状况评分（0～4分）、分期（Ⅰ～Ⅳ期）、LDH比值以及结外病灶数量等。其中2例患者OS为0，无法用于生存分析建模，因此本研究总共纳入患者412例。

1.2 方法

1.2.1 肿瘤微环境中免疫细胞丰度计算 从GEO数据平台下载DLBCL全基因组表达谱数据（GSE10846），将数据导入R软件并采用hgu133plus2.db程序包对探针进行基因名称注释，删除未匹配基因名称的探针数据，去重并保留每个基因的最大值。采用ImmuCellAI算法［13］计算DLBCL肿瘤微环境中包含18种T细胞亚型在内的24种免疫细胞类型的丰度和一个浸润评分共25个自变量。预测建模的响应变量为患者的生存信息以及通过ImmuCellAI 算法得到的DLBCL 患者ICPIs 疗效预测结果。

1.2.2 预测模型的构建 根据ImmuCellAI 计算得到的25 个变量，删除丰度值为0 的比例＞20%的免疫细胞类型，得到19 个变量。采用5 倍交叉验证的LASSO回归进行变量筛选，根据最佳lambda值0.035筛选出9 个变量。采用上述9 个变量进行多因素Cox 分析，并采用双向逐步回归法进行二次变量筛选，最终筛选出6 个变量。根据最终筛选出的变量构建基于免疫细胞的风险评分模型（immune cells-based risk scores，IRS）模型，并计算风险评分。结合IRS模型和患者临床因素，采用Cox回归构建IRSC模型

1.2.3 预后模型效力评估 采用survminer程序包计算风险评分，并根据最佳切割点将DLBCL 患者分为高风险组和低风险组。接受R-CHOP 或CHOP 方案治疗的两个组的高、低风险分组均基于survminer 程序包重新计算最佳切割点并基于最佳切割点进行二次分组。采用survminer 程序包进行Kaplan-Meier 生存曲线分析，采用timeROC 程序包进行ROC 曲线分析，采用nricens 程序包计算净重新分类指数（net reclassification index，NRI），采用ggDCA 程序包绘制DCA曲线，采用RMS程序包绘制列线图，采用ggplot2和pheatmap程序包绘制IRS模型中免疫细胞热图。

1.3 统计学分析

采用Kaplan-Meier生存曲线进行生存分析，各组之间的生存时间比较采用Log-rank检验；采用多因素Cox回归模型分析影响预后的因素；采用ROC曲线和AUC值评估不同时间点预后模型的预测价值，截断值为统计工具预设的50%；Cox回归模型等比例风险假定的检验是通过计算Schoenfeld残差并评估和时间之间的关联性来实现的，基线风险常数为2.636 488；采用DCA曲线评估预后模型的临床应用价值；采用列线图来预测患者1、3、5年的生存概率。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 基于免疫细胞的风险评分模型（IRS模型）的构建

采用ImmuCellAI算法计算DLBCL肿瘤微环境中24种免疫细胞类型的丰度，进一步删除免疫细胞丰度值为0的比例＞20%的免疫细胞类型（表1）。采用5倍交叉验证的LASSO回归进行初步变量筛选，得到9个自变量。进一步采用双向逐步回归法进行二次变量筛选，最终得到基于6种免疫细胞（Tfh、Central Memory、DC、CD8+T、Macrophage和NK）丰度的预测模型（表2），并作为自变量纳入多变量风险比例模型，构建基于免疫细胞的风险评分模型（IRS模型）。等比例风险假定的检验结果见图1，Schoenfeld残差检验的（均P＞0.05），与时间之间无关联性。采用survminer程序包计算DLBCL患者风险评分的最佳切割值，将患者按照风险评分分为高风险组和低风险组（图1）。

表1 24种免疫细胞的名称

2.2 IRS模型的评价

Kaplan-Meier 生存曲线分析结果显示高风险患者OS 显著低于低风险组［图2A，P=1e-15，HR=0.298（0.217 6～0.408 2）］。亚组分析结果显示，接受CHOP方案和R-CHOP方案治疗的DLBCL患者中，高风险组患者的预后也显著差于低风险组［图2B：CHOP 组，P=2e-05，HR=0.407（0.267 1～0.620 1）；图2C：R-CHOP 组，P=1e-10，HR=0.212 4（0.126 7～0.356）］。为进一步探讨IRS 模型的预后预测价值，绘制ROC 曲线并计算1、3、5 年AUC 值分别为0.728、0.711和0.615，结果见图2D。

为更方便进行预后评估，通过列线图计算模型中6 种免疫细胞对应的总评分来评估患者1、3、5 年的生存情况（图3）。

表2 IRS预测模型中的6种免疫细胞

2.3 IRS模型与ICPIs疗效的相关性研究

使用IRS模型计算每例患者的风险评分，根据评分排序和最佳切割点绘制条形图（绘图数据：风险评分-最佳切割值）。风险评分＞0分的部分为预后较差高风险组，风险评分＜0 分的部分为预后较好的低风险组。采用ImmuCellAI 算法预测DLBCL 患者对ICPIs疗效的敏感性，并将患者分为ICPIs有效组和无效组。如图4A所示，ICPIs有效患者多集中在预后较差的高风险组，而ICPIs 无效患者多集中在预后较好的低风险组，提示IRS 模型或可作为ICPIs 疗效预测的工具。此外，本研究还绘制了基于IRS 模型预测ICPIs疗效的列线图（图4B）。

图2 IRS模型的评价

▶图3 IRS模型中6种免疫细胞预测1、3、5生存情况的列线图

图4 IRS模型与ICPIs疗效的相关性

2.4 RS模型结合临床相关因素的IRSC模型

为进一步提升IRS 模型的预测效能，将患者性别、年龄、分期、分子亚型等临床相关因素结合IRS模型，构建了IRSC 模型。采用survminer 程序包计算新的风险评分，并根据最佳切割点将DLBCL 患者分为高风险组和低风险组。Kaplan-Meier 生存曲线分析结果显示高风险组预后显著差于低风险组［图5A，P＜2e-16，HR=0.170（0.114 3～0.253 0）］，并且较IRS 模型预后效果更佳。ROC 曲线分析结果显示，IRSC 模型预测DLBCL患者1、3、5年生存情况的AUC值分别为0.797、0.809和0.792（图5B），均优于IRS 模型。同时构建列线图计算患者的1、3、5年生存率。图5C为IRSC模型中临床因素和6种免疫细胞丰度预测1、3、5 年生存情况的列线图。IRSC 模型的NRI=0.235，提示IRSC模型的预测效力有较大的提升。DCA曲线结果也显示IRS模型可带来显著的临床获益，而结合临床相关因素的IRSC 模型的DCA 曲线显著高于IRS，提示其临床应用价值更为显著（图5D）。

图5 RS模型结合临床相关因素的IRSC模型

3 讨论

DLBCL 为最常见的非霍奇金淋巴瘤类型。RCHOP是DLBCL的一线治疗方案，虽然大部分患者疗效显著，但存在着相当比例的原发和继发性耐药［14-15］。目前，用于预测和评估DLBCL 患者疗效及预后的指标仍为传统的IPI 或NCCN-IPI 评分体系。而免疫化疗时代，尚缺乏大样本量基于肿瘤浸润免疫细胞的预测模型用于评估DLBCL患者的疗效和预后。筛选新的DLBCL预后标记物或者预后数学模型对于DLBCL的个性化精准治疗具有重大临床价值［16］。

本研究采用ImmuCellAI算法计算DLBCL肿瘤微环境中24 种免疫细胞类型的丰度，通过LASSO 回归筛选预测变量，构建多因素COX 回归模型并采用双向逐步回归进一步筛选变量并构建包含6 种免疫细胞类型的IRS模型。生存分析和ROC曲线分析显示，该模型在DLBCL整体人群、CHOP方案治疗人群、RCHOP 方案治疗人群中均具有较高的预后价值。多因素分析结果显示，肿瘤组织中DC、CD8+T等细胞类型的丰度与OS呈显著正相关，而Macrophage与OS呈显著负相关。同时，本研究还采用ImmuCellAI 算法获得了DLBCL 患者的ICPIs 疗效信息。分析发现风险评分与ICPIs疗效呈正相关。传统方案疗效欠佳的患者可能在ICPIs 治疗中获益，而传统方案疗效较好的患者从ICPIs 治疗中获益有限，提示IRS 模型可作为ICPIs疗效预测的工具之一。

为进一步提升模型的预后价值，本研究将临床因素和IRS 模型的风险评分相结合，构建了IRSC 预测模型。Kaplan-Meier 生存曲线分析和ROC 曲线分析结果显示，结合临床因素的IRSC 模型具有更好的预后价值（如HR、P值，不同OS AUC 值均有较大提升）。近期有研究也采用肿瘤浸润免疫细胞来预测DLBCL 患者的预后［12］，与本研究思路类似。但与本研究采用数据不同，免疫细胞类型也有很大差异，因此不影响本研究的创新性。此外，本研究还将IRS模型与患者临床信息相结合构建了IRSC 预后模型，相比单纯免疫细胞模型的预后价值有全面的提高。

综上所述，本研究发现基于肿瘤浸润免疫细胞的IRS模型能很好的预测DLBCL患者的预后及对ICPIs 的疗效，而结合免疫细胞模型和患者临床因素的IRSC模型预后价值更高，对于DLBCL患者的个体化、精准化治疗选择及改善患者的预后具有重要的临床实际意义和参考价值。本研究也存在一定的局限性：1）本研究结果是基于可公开获得的数据库，其中部分患者的相关信息难免存在一定的不完整性；2）也无法保证所述肿瘤及其微环境区域选择的客观准确性。亟需大样本、多中心、前瞻性、随机对照研究去验证、优化本研究构建模型的预测及预后价值。