高效液相色谱–串联质谱法同时测定饲料中10 种喹噁啉类和四环素类抗生素

2021-05-24严明唐建严寒索德成

化学分析计量 2021年5期

严明，唐建，严寒，索德成

（1.广西壮族自治区兽药监察所，南宁 530001; 2.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京 100081）

喹噁啉类抗生素是化学合成的具有喹噁啉-1，4-二氧化物母核结构的化合物，主要包括卡巴氧、喹乙醇、喹烯酮、喹赛多和乙酰甲喹。四环素类抗生素是由放线菌产生的一类广谱抗生素，包括金霉素、土霉素、四环素及半合成衍生物甲烯土霉素、强力霉素等，其结构中均含有并四苯基本骨架［1–2］。这两类化合物均具有抗菌、促生长等作用，被广泛用作猪、鸡、鱼等动物的饲料添加剂［3–5］。近年来，抗生素的耐药性和潜在危害成为关注的热点［6–7］，按照《全国遏制动物源细菌耐药行动计划》部署，为维护我国动物源性食品安全和公共卫生安全，农业部发布了中华人民共和国农业农村部公告第194 号，决定停止生产、进口、经营、使用部分药物饲料添加剂，自2020 年7 月1 日起，饲料生产企业停止生产含有包括喹噁啉类和四环素类抗生素在内的促生长类药物饲料添加剂（中药类除外）的商品饲料［8–9］。为了有效监管饲料中喹噁啉类和四环素类抗生素的非法使用，建立饲料中喹噁啉类和四环素类抗生素的检测方法十分必要。

目前饲料中喹噁啉类和四环素类抗生素的测定方法主要有高效液相色谱法［10–22］、液相色谱–质谱联用法［23–29］，涉及的样品主要以动物组织和环境样品为主［16–28］。高效液相色谱法检测灵敏度低，并且无法作为确证检测技术［29］。液相色谱–质谱联用法主要用于单独测定喹噁啉类或四环素类抗生素［23–28］，并且操作复杂，检测灵敏度和回收率较低，无法实现饲料中喹噁啉类和四环素类抗生素的同时测定。笔者通过对提取溶剂、净化等前处理条件及仪器工作条件的优化，建立了高效液相色谱–串联质谱法同时测定饲料中卡巴氧、喹乙醇、喹烯酮、喹赛多、乙酰甲喹5 种喹噁啉类抗生素和金霉素、土霉素、四环素、甲烯土霉素、强力霉素5 种四环素类抗生素的方法。该方法准确、可靠，灵敏度高，适用于饲料中喹噁啉类和四环素类抗生素的确证监测和定量分析，可为饲料安全监管提供技术支撑。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱–串联质谱仪：Waters TQS 型，配有电喷雾电离源(ESI 源)，美国沃特世公司。

固相萃取柱：Estela HLB SPE 柱，60 mg／3 mL，大连沈源检验检测咨询有限公司。

电子天平：XY500–2c 型，感量为0.01 g，天津市精拓仪器科技有限公司。

分析天平：XSR204／AC 型，感量为0.1 mg，梅特勒–托利多国际有限公司。

氮气发生器：Genius XE 35 型，毕克气体仪器贸易（上海）有限公司。

尼龙滤膜：0.22 μm，上海安谱实验科技股份有限公司。

氮气：体积分数大于99.99%，由Genius XE 35型氮气发生器制备。

甲酸：质谱纯，美国希格玛公司。

乙腈、甲醇：均为色谱纯，美国赛默飞世尔科技有限公司。

其它试剂均为分析纯，北京化学试剂公司。

10 种抗生素标准品：基本信息见表1。

表1 10 种抗生素标准品基本信息

实验用水为超纯水，电阻率大于18 MΩ·cm，由Mili-Q 超纯水系统纯化制得。

配合饲料与浓缩饲料样品：南宁大北农饲料科技有限责任公司。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 液相色谱

色谱柱：Waters BEH C18柱（100 mm×3.0 mm，1.7 μm，美国沃特世公司）；柱温：25 ℃；进样体积：5 μL；流动相：0.1%甲酸水溶液（A）–乙腈（B），流量为0.3 mL／min；洗脱方式：梯度洗脱；洗脱程序：0.0～2.0 min 时，流动相A 为90%，2～3.5 min 时，流动相A 从90%逐步降至75%，3.5～6.0 min 时，流动相A 从75%逐步降至20%，保持1.0 min，7.1 min时，流动相A 为90%，保持0.9 min。

1.2.2 质谱

离子源：电子喷雾，正离子检测（ESI+）；监测模式：多反应监测（MRM）模式；喷雾电压：3 200 V；毛细管温度：350 ℃；脱溶剂气和碰撞气：高纯氮气，使用前调节各气体流量使质谱灵敏度达到检测要求；数据采集方式：分段采集；10 种抗生素的质谱参数见表2。

1.3 样品处理

称取5 g（精确至0.01 g）饲料样品，加入McIlvaine-Na2EDTA 缓冲液（MC 溶液）–乙腈(体积比为4∶6）混合溶液20 mL，超声提取30 min，以10 000 r／min 转速离心5 min。取5 mL 上清液，于40 ℃下氮气吹至1 mL 左右，加入2 mL 磷酸二氢钠缓冲溶液，漩涡混匀，备用。

表2 10 种抗生素的质谱参数

HLB 固相萃取柱依次用3 mL 甲醇、3 mL 水活化，准确移取3 mL 备用液过柱，用3 mL 水、3 mL 1%甲酸溶液依次淋洗，抽干。用3 mL 甲醇洗脱，收集洗脱液，于40 ℃下氮气吹至近干。准确加入1 mL 甲醇–0.1%甲酸溶液（体积比为1∶9）溶解残余物，混匀后过0.22 μm 尼龙滤膜，待测。检测过程中注意避光操作。

1.4 溶液配制

柠檬酸溶液：0.1 mol／L，称取21.01 g 柠檬酸，用水溶解并稀释至1 000 mL。

磷酸氢二钠溶液：0.2 mol／L，称取71.63 g 磷酸氢二钠，用水溶解并稀释至1 000 mL。

盐酸溶液：1 mol／L，移取9 mL 盐酸，用水稀释至100 mL。

氢氧化钠溶液：1 mol／L，称取4 g 氢氧化钠，用水溶解并稀释至100 mL。

MC 溶液：取柠檬酸溶液1 000 mL、磷酸氢二钠溶液625 mL，混合均匀，用盐酸溶液或氢氧化钠溶液调节pH 至4.0±0.05。加入60.5 g 乙二胺四乙酸二钠，溶解，混合均匀。

MC 溶液–乙腈混合溶液（体积比为4∶6）：取MC 溶液400 mL、乙腈600 mL，混合均匀。

卡巴氧、喹乙醇、喹烯酮、喹赛多、乙酰甲喹混合标准储备溶液：各组分质量浓度均为1 mg／mL，准确称取卡巴氧、喹乙醇、喹烯酮、喹赛多、乙酰甲喹标准品各10 mg，置于10 mL 棕色容量瓶中，用2 mL 二甲基亚砜超声溶解，加入甲醇定容至标线，摇匀。

金霉素、土霉素、四环素、甲烯土霉素、强力霉素混合标准储备溶液：各组分质量浓度均为1 mg／mL，准确称取金霉素、土霉素、四环素、甲烯土霉素、强力霉素标准品各10 mg，置于10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至标线，摇匀。

10 种抗生素混合标准工作溶液：每种抗生素的质量浓度均为10 μg／mL，分别吸取100 μL 卡巴氧、喹乙醇、喹烯酮、喹赛多、乙酰甲喹混合标准储备溶液和100 μL 金霉素、土霉素、四环素、甲烯土霉素、强力霉素混合标准储备溶液，置于10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇稀释并定容至标线，摇匀。

10 种抗生素系列混合标准工作溶液：依次吸取10 种抗生素混合标准工作溶液5、10、20、50、100、200，500 μL，分别置于7 只10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇–0.1%甲酸溶液（1∶9）稀释并定容至标线，摇匀，配制成10 种抗生素的质量浓度均分别为5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200、500 μg／L 的系列混合标准工作溶液。

10 种抗生素系列基质混合标准工作溶液：分别取不同基质的空白饲料样品各7 份，按1.3 方法处理，吹干，分别加入1 mL 质量浓度为5.0，10.0，20.0，50.0，100.0，200，500 μg／L 的系列混合标准工作溶液，配制成10 种抗生素的质量浓度均分别为5.0，10.0，20.0，50.0，100.0，200，500 μg／L 的系列基质混合标准工作溶液。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱选择

分别考察Waters BEH C18柱（100 mm×3.0 mm，1.7 μm）、Waters HSS T3 C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、Waters BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）3 种C18色谱柱的分离效果。结果表明，Waters HSS T3 C18色谱柱分离效果较差，对喹噁啉类和四环素类抗生素保留较弱，饲料中部分杂质对喹噁啉类和四环素类抗生素产生干扰，部分喹噁啉类和四环素类抗生素色谱峰形拖尾。Waters BEH C18色谱柱克服了大多数C18柱在低离子强度流动相条件下因载量所导致的色谱峰形差的问题，有效改善了喹噁啉类和四环素类抗生素的色谱峰形。内径较大的Waters BEH C18柱（100 mm×3.0 mm，1.7 μm）具有较高的理论塔板系数，相比Waters BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7µm）具有更好的分离效果，因此选择Waters BEH C18柱（100 mm×3.0 mm，1.7 μm）。

2.2 流动相选择

分别考察了甲醇–0.1%甲酸溶液、乙腈–0.1%甲酸溶液2 种流动相体系对喹噁啉类和四环素类抗生素的分离效果。结果表明，甲醇–0.1%甲酸溶液作为流动相体系时，无法使甲烯土霉素、强力霉素达到满意的分离效果；乙腈–0.1%甲酸溶液作为流动相时，采用梯度洗脱，10 种喹噁啉类和四环素类抗生素能够完全分离，且色谱峰形对称。为了避免杂质干扰，采取分段采集的方式，有效提高了方法灵敏度。以乙腈–0.1%甲酸溶液为流动相，在1.2.1 梯度洗脱条件下，10 种抗生素混合标准溶液的色谱图如图1 所示。

2.3 提取条件选择

图1 10 种抗生素混合标准溶液色谱图

喹噁啉类和四环素类抗生素的结构和性质差异不大，提取剂选择至关重要。根据文献［13–16，20–24］，喹噁啉类抗生素常用的提取剂主要有甲醇、氯仿、乙酸乙酯和乙腈等单一或混合溶剂，四环素类抗生素常用MC 溶液与一定比例的乙腈或甲醇组成的混合溶液进行提取。分别选择甲醇、乙腈、二氯甲烷、MC 溶液、MC 溶液–乙腈混合溶液作为提取溶剂，考察不同溶剂对饲料中10 种喹噁啉类和四环素类抗生素的提取效果，结果如图2 所示。由图2 可以看出，二氯甲烷和甲醇总体提取效果较差。乙腈对喹噁啉类抗生素提取效果较好，MC 溶液对四环素类抗生素提取效果好。MC 溶液–乙腈混合溶液对10 种待测物均具有较好的提取效果，以MC 溶液–乙腈（4∶6）混合溶液为提取溶剂，10 种待测抗生素的回收率均大于75%。故选择MC 溶液–乙腈（4∶6）混合溶液为提取溶剂。

图2 不同提取溶剂时10 种抗生素的回收率

2.4 固相萃取柱选择

饲料成分复杂，部分杂质会影响测定结果的准确性，因此需要对饲料提取液净化处理。常用的净化方法主要有液液萃取法和固相萃取法。固相萃取法试剂用量少，且净化效果好。目前用于喹噁啉类药物和四环素类药物的固相萃取柱有HLB 柱、C18柱等。分别采用Waters Oasis HLB SPE 柱、Esela HLB SPE 柱和Aglinet C18SPE 柱对提取液进行净化，考察不同固相萃取柱的净化效果，结果如图3 所示。由图3 可以看出，在1 000 μg／L 添加水平下，HLB 柱、C18柱对10 种抗生素均具有较好的保留。Esela HLB SPE 柱所装的填料颗粒较大，样品溶液更容易流过SPE 柱，操作更为简单，而且批内变异系数小，价格比Waters Oasis HLB SPE 柱更低，因此选择Esela HLB SPE 柱作为净化柱。

图3 不同固相萃取柱净化时10 种抗生素的回收率

2.5 基质效应

不同饲料样品的组成比较复杂，液相色谱–质谱法分析时基质干扰非常明显。为了考察基质效应的影响，采用空白样品加标的色谱峰面积与溶剂加标的色谱峰面积的比值，对基质效应进行评估，以所得色谱峰面积的比值R表示基质效应。若R=1，说明无基质效应；若R＜1，呈基质抑制效应；若R＞1，呈基质增强效应。结果表明，饲料中10 种抗生素的R为0.779～0.868，存在明显的基质抑制效应。为消除基质效应，获得更准确的定量结果，采取基质匹配标准曲线校正法进行定量分析。

2.6 线性方程、检出限与定量限

按照1.2 仪器工作条件，分别对1.4 中的系列基质混合标准工作溶液进行测定，以待测抗生素的质量浓度（x）为横坐标，以定量离子色谱峰面积（y）为纵坐标，绘制标准工作曲线，计算线性方程和相关系数。以定量离子色谱峰的信噪比(S／N)大于3 所对应的待测离子的质量浓度作为方法检出限，S／N大于10 所对应的待测离子的质量浓度作为定量限。10 种抗生素的线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限见表3。由表3 可知，10 种抗生素的质量浓度在5.0～500 μg／L 范围内与色谱峰面积具有良好的线性关系，相关系数为0.990～0.997，检出限和定量限均满足检测要求。

2.7 加标回收和精密度试验

精密称取空白配合饲料与空白浓缩饲料样品各5 g，分别加入适量的喹噁啉类和四环素类抗生素标准溶液，配制成10 种抗生素加标质量浓度均分别为50、100、1 000 ng／g 的加标样品溶液，每个添加水平平行制备5 份，在1.2 仪器工作条件下分别进行测定，结果见表4。由表4 可知，在高、中、低3 种加标水平下，空白样品加标回收率为76.3%～99.9%，测定结果的相对标准偏差为0.5%～11.4%。表明该方法具有较高的准确度和精密度。