高效液相色谱法测定皱皮木瓜饮片中齐墩果酸和熊果酸

2021-05-24齐红李敏张秋红

化学分析计量 2021年5期

齐红，李敏，张秋红

（济南市食品药品检验检测中心，济南 250102）

木瓜为常用中药，俗称皱皮木瓜，最早载于《尔雅》，为蔷薇科木瓜属植物贴梗海棠Chaenomeles speciosa(Sweet) Nakai 的干燥近成熟果实，可舒筋活络，和胃化湿，临床多用于治疗由湿引起的各种筋病，如湿痹拘挛，转筋挛痛，腰膝关节疼痛等，不作君药，可作佐、使药物［1］。光皮木瓜是皱皮木瓜常见的习用品［2］，光皮木瓜在山东、四川、河北、陕西等省的地方标准中有收载，两者在原植物形态、药材外观性状和活性成分等方面存在差异［3］，不能混用。木瓜收载于国家药典标准始于《中国药典》1963 年版一部，《中国药典》2020 年版收载了27 个含有木瓜的复方制剂［4］。木瓜的主要化学成分包括齐墩果酸、熊果酸、绿原酸、苹果酸、芦丁、槲皮素、多糖、鞣质等［5–9］，其中齐墩果酸、熊果酸不仅具有消炎抑菌、降低转氨酶、促进肝细胞再生、防止肝硬化等功效，而且还具有一定的抗癌活性［10–11］，且以熊果酸尤为突出，是木瓜的主要药效成分，因此测定木瓜中齐墩果酸和熊果酸具有重要意义。

目前测定齐墩果酸、熊果酸的方法主要是采用高效液相色谱法［12–14］。此外周静等［15］采用气相色谱法，以氮气为载气，选用HP1 毛细管柱（25 m×0.32 mm，0.52 μm），柱温为280 ℃，氢火焰检测器对女贞子中齐墩果酸和熊果酸含量进行测定，要求柱温较高，且易引起毛细管柱涂层流失。戴云等［16］采用分光光度法测定了齐墩果酸和熊果酸对DPPH 自由基的清除率，齐墩果酸和熊果酸分子结构中仅有一个双键，紫外吸收弱，操作简便，但准确度较低。冯海燕等［17］采用毛细管电泳法测定柿蒂中齐墩果酸和熊果酸含量，操作复杂，且重现性较差。《中国药典》2020 年版木瓜药材采用HPLC 法测定齐墩果酸、熊果酸的总量，该方法以甲醇–水–冰醋酸–三乙胺为流动相，配制较复杂，且三乙胺会缩短色谱柱寿命。与《中国药典》2015 年版相比，2020 年版木瓜质量标准饮片项下增加了浸出物项目，饮片中齐墩果酸、熊果酸含量测定则未作规定。不同方法制备的木瓜饮片中齐墩果酸、熊果酸含量不同［18］，此外不同产地、不同品种木瓜饮片中齐墩果酸、熊果酸含量也存在差异。为评价木瓜饮片质量，保证药品质量安全、有效，笔者从四川、湖北、安徽、山东等地收集部分皱皮木瓜和光皮木瓜市售饮片，通过试验对提取条件、色谱条件进行优化，建立了高效液相色谱法测定不同产地皱皮木瓜饮片中齐墩果酸和熊果酸含量的方法。与《中国药典》2020年版一部木瓜含量测定方法相比，该方法操作简单、分离度好、准确度高，可用于木瓜饮片中齐墩果酸和熊果酸的测定。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试药

高效液相色谱仪：LC–20AT 型，LCsolution 工作站，岛津企业管理（中国）有限公司公司。

数控超声波清洗器：KQ–600GDV 型，昆山市超声仪器有限公司。

高速万能粉碎机：FW100 型，天津市泰斯特仪有限公司。

电子天平：MS204TS 型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒–托利多仪器公司。

齐墩果酸对照品：批号为110709–201607，质量分数为91.7%，中国食品药品检定研究院。

熊果酸对照品：批号为110742–201622，质量分数为94.7%，中国食品药品检定研究院。

乙腈、甲醇：色谱纯，安徽天地高纯溶剂有限公司。

磷酸：分析醇，国药集团化学试剂有限公司。

实验用水为纯净水。

木瓜饮片样品：皱皮木瓜饮片为贴梗海棠Chaenomeles speciosa(Sweet) Nakai 的果实，光皮木瓜为木瓜Chaenomeles sinensis(Thouin) Koehne 的果实，具体信息见表1。

表1 样品信息

1.2 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，瑞典Nouryon 公司）；流动相：甲醇–0.3%磷酸（87∶13）溶液；检测波长：210 nm；流量：1.0 mL／min；柱温：25 ℃；进样体积：10 μL。

1.3 对照品混合溶液制备

精密称取齐墩果酸对照品8.96 mg，熊果酸对照品13.61 mg，置于100 mL 容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至标线，摇匀，配制成齐墩果酸、熊果酸的质量浓度分别为0.082 2、0.128 9 mg／mL 的对照品混合溶液。

1.4 供试品溶液制备

精密称取皱皮木瓜饮片细粉约1.0 g，置于具塞锥形瓶中，加入25 mL 甲醇，密塞，称量并记录质量，超声处理（功率为500 W，频率为40 kHz）40 min，冷却至室温，再次称量并记录质量，用甲醇补足减少的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即为供试品溶液。

2 结果与讨论

2.1 系统适应性试验

精密吸取对照品混合溶液、供试品溶液各10 μL，按1.2 色谱条件分别进样测定。结果表明，对照品混合溶液和供试品溶液中齐墩果酸、熊果酸分离度均大于1.5，拖尾因子为1.04，理论板数按熊果酸色谱峰计不低于5 000。系统适应性试验符合要求。对照品混合溶液、供试品溶液色谱图如图1 所示。

图1 对照品混合溶液、供试品溶液色谱图

2.2 提取条件选择

以编号为16 的皱皮木瓜饮片样品为待测对象，分别选择甲醇、乙醇、体积分数为70%的甲醇溶液3 种提取溶剂对齐墩果酸、熊果酸进行提取，考察不同提取溶剂的提取效果，结果表明，以甲醇为提取溶剂时，色谱峰面积最大，基线平稳，故采用甲醇为提取溶剂。以甲醇为提取溶剂，分别采用超声法、回流法、索氏提取法对齐墩果酸、熊果酸进行提取，考察不同提取方法的提取效果，结果表明，3 种提取方法的色谱峰面积接近，但超声法简单、方便，故选用超声法对样品进行提取。分别考察超声时间为20、40、60 min 时的提取效果，结果表明，超声提取40 min 时，提取较完全，故选择超声时间为40 min。

2.3 色谱条件优化

分别考察乙腈–0.3%磷酸溶液、甲醇–水–冰醋酸–三乙胺溶液、甲醇–0.3%磷酸溶液3 种流动相体系，结果发现，以乙腈–0.3%磷酸溶液为流动相时，齐墩果酸、熊果酸分离度仅为1.3；以甲醇–水–冰醋酸–三乙胺溶液、甲醇–0.3%磷酸溶液为流动相时，齐墩果酸、熊果酸分离度均大于1.5。甲醇–水–冰醋酸–三乙胺（265∶35∶0.1∶0.05）溶液配制较复杂，三乙胺会缩短色谱柱寿命，且柱温需控制在16～18 ℃，而甲醇–0.3%磷酸溶液（87∶13）配制简单，操作容易，综合考虑，选择甲醇–0.3%磷酸溶液为流动相。

分别选择Agilent Zorbax SB C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）、SHIMADZU VP–ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）和Kromasil 100–5–C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）对齐墩果酸、熊果酸进行分离，发现Kromasil 100–5–C18柱分离效果较好，齐墩果酸和熊果酸的色谱峰分离度均为1.7，其余两款色谱柱的分离度均小于1.5。故选择Kromasil 100–5–C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）色谱柱。

2.4 线性方程与检出限

自动进样器分别自动吸取1.3 中的对照品混合溶液8、10、12、15、20、25 μL，注入液相色谱仪，在1.2 色谱条件下，依次进样测定，以待测化合物的质量浓度（X）为横坐标，以色谱峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准工作曲线，计算线性方程和相关系数。用甲醇逐级稀释对照品混合溶液，在1.2 色谱条件下进样测定，以3 倍信噪比（S／N）对应的溶液浓度作为方法检出限。齐墩果酸、熊果酸的线性范围、线性方程、相关系数及检出限见表2。

表2 齐墩果酸、熊果酸的线性范围、线性方程、相关系数及检出限

2.5 稳定性试验

选择编号为16 的皱皮木瓜饮片，按1.4 方法制备供试品溶液，分别于制备完成后第0、2、4、6、12、24 h 进样测定，结果见表3。由表3 可知，齐墩果酸、熊果酸色谱峰面积测定结果的相对标准偏差分别为0.89%、1.09%，表明供试品溶液在24 h内稳定性较好。

表3 稳定性试验结果

2.6 精密度试验

取编号为16 的皱皮木瓜细粉6 份，每份约1.0 g，按1.4 方法制备供试品溶液，在1.2 色谱条件下分别进样测定，结果见表4。

表4 精密度试验结果

由表4 可知，齐墩果酸、熊果酸色谱峰面积测定结果的相对标准偏差分别为0.95%、1.14%，表明该方法精密度较好，满足测定要求。

2.7 加标回收试验

取编号为16 的皱皮木瓜细粉6 份，每份约0.5 g，分别加入适量的齐墩果酸、熊果酸对照品，按1.4 方法制备供试品溶液，在1.2 色谱条件下分别进样测定，结果见表5。由表5 可知，齐墩果酸、熊果酸加标回收率分别为96.10%～99.15%、95.50～99.07%，表明该方法准确度较高。

表5 加标回收试验结果

2.8 实际样品测定

分别取编号为1～18 的木瓜细粉各约1.0 g，按1.4 方法制备供试品溶液，在1.2 色谱条件下分别进样测定，结果见表6。

表6 木瓜样品中熊果酸、齐墩果酸质量分数测定结果 %

由表6 可知，皱皮木瓜饮片中齐墩果酸、熊果酸总含量为0.41%～0.87%，不同产地的皱皮木瓜饮片中齐墩果酸、熊果酸总含量存在较大差异，四川的样品含量较高。《中国药典》2020 年版一部木瓜药材含量规定，齐墩果酸和熊果酸总量不得少于0.50%，按此限度有2 批样品不合格。光皮木瓜中齐墩果酸和熊果酸含量较低，总量仅为0.20%，其中熊果酸含量较高，因此建议皱皮木瓜饮片质量标准中有必要增加齐墩果酸、熊果酸含量测定项目。