高效液相色谱–电感耦合等离子体串联质谱法测定水样中6 种硒形态

张蜀，张珂，高舸

（成都市疾病预防控制中心，成都 610041）

硒是动物体内必需的微量营养元素之一，在抗氧化物酶和谷胱甘肽过氧化物酶的形成过程中起着重要作用，具有防癌、抗癌、抗氧化等多种生理功能。硒摄入不足会导致肝坏死，肌肉营养不良，可能引发克山病、大骨节病、癌症、心脏病等多种疾病［1–2］。无机硒的生物利用率差、毒性大；而有机硒安全性高、更易于被人体吸收利用。由于硒的生物利用性、毒性与其存在形态有着密切的关系，因此对硒的存在形态及含量进行分析尤为重要［2–6］。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：1260 Infinity 型，安捷伦科技(中国)有限公司。

电感耦合等离子体质谱仪：8900 型，安捷伦科技(中国)有限公司。

超纯水系统：Milli-Q Advantage 型，默克密理博（中国）有限公司。

高纯氩：体积分数为99.999%，成都世茂气体有限公司。

pH 计：510 型，美国优特公司。

柠檬酸：质量分数不低于99.5%，CAS 号为77–92–9，西格玛奥德里奇（中国）有限公司。

己烷磺酸钠：质量分数不低于98%，CAS 号为2832–45–3，西格玛奥德里奇（中国）有限公司。

氨水：质量分数为20%～22%，A512–P500，赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

硒代乙硫氨酸标准品：CAS 号为2578–27–0，质量分数为98%，加拿大TRC 公司。

普通饮用水样品：乐百氏桶装饮用水，乐百氏饮用水有限公司。

富硒矿泉水样品：稀世宝饮用天然矿泉水，恩施硒之泉矿泉水有限公司。

实验用水为超纯水。

1.2 溶液配制

SeEt 标准储备溶液：25 μg／mL，称取SeEt 固体粉末6.79 mg，溶于适量超纯水中，定容至100 mL（硒形态质量浓度以硒计）。

6 种硒形态混合标准溶液：1.00 μg／mL，分别准确吸取6 种硒形态标准储备溶液各400 μL，置于同一只10 mL 容量瓶中，用超纯水稀释并定容至标线，摇匀。

标准品及溶液标准物质于4 ℃下冷藏保存，所有工作溶液均为现配现用。

1.3 仪器工作条件

1.3.1 色谱

色 谱 柱：Zorbax SB–Aq 型 反 相 色 谱 柱[150 mm×4.6 mm，5 μm，安捷伦科技（中国）有限公司]；柱温：25 ℃；流动相：1%甲醇–pH 值分别为2.7、7.0的10 mmol／L 柠檬酸溶液（含5 mmol／L 己烷磺酸钠）；洗脱方式：梯度洗脱，洗脱条件见表1；进样体积：10 μL；流量：1 mL／min。

表1 梯度洗脱条件

1.3.2 质谱

射频功率：1 550 W；玻璃同心雾化器；采样深度：8.0 mm；蠕动泵转速：0.3 r／s；载气：高纯氩气，流量为0.90 L／min；补偿气：高纯氩气，流量为0.25 L／min；雾化室温度：2 ℃；积分时间：0.5 s；采集时间：10 min；反应气：氧气，流量为25%；采集质量数：双重四级杆Q1、Q2质量数分别为80、96。

1.4 样品处理

水样及加标样品经孔径为0.22 μm 的聚四氟乙烯滤头过滤后测定。

2 结果与讨论

2.1 流动相优化

2.1.1 流动相选择

2.1.2 己烷磺酸钠溶液浓度选择

在流动相中添加己烷磺酸钠等离子对试剂可改善各硒形态的分离效果［6］。考察流动相中分别添加浓度为5、10、20 mmol／L 己烷磺酸钠溶液对各硒形态分离的影响。结果表明，己烷磺酸钠溶液浓度的增大可使各硒形态出峰时间轻微延迟，但对峰形及出峰时间的影响不明显，故选择在流动相中添加浓度为5 mmol／L 的己烷磺酸钠溶液。

2.1.3 甲醇用量选择

考察流动相中添加体积分数分别为0%、1%、2%、4%、6%的甲醇对各硒形态分离的影响。结果表明，甲醇的加入对无机硒形态出峰时间无影响，但可使有机硒形态的出峰时间略微提前。甲醇添加量从0%增加至1%时，各硒形态的色谱峰强度均有明显增高；继续增加甲醇浓度，各硒形态色谱峰强度变化较小；在甲醇添加量较大时强度开始减弱（如图1 所示）。综合分析色谱峰强度及出峰时间，选择在流动相中添加体积分数为1%的甲醇。

图1 流动相中甲醇用量对各硒形态分离的影响

2.1.4 流动相pH 值选择

图2 流动相不同pH 值时各硒形态的分离时间

2.2 碰撞反应气优化

以O2为碰撞反应气，分别考察质量浓度为20 ng／mL 的SeO42–标准溶液及空白溶液在不同O2含量（氧气体积分数分别为0%、5%、7%、9%、11%、13%、15%、17%、19%、21%、23%、25%、27%、29%、31%、33%、37%、39%、41%、43%、45%、47%、49%、51%、53%、55%、57%）下的信号和背景强度（如图3所示）。结果表明，当碰撞反应池气体O2体积分数为25%时，硒元素的信噪比较好，故采用碰撞反应池气体O2体积分数为25%。

图3 不同含量O2 下的信号和背景强度

2.3 线性方程与检出限

在1.3 仪器工作条件下，对1.2 中6 种硒形态系列混合标准工作溶液进行测定，以各硒形态的质量浓度（x）为横坐标，响应强度（y）为纵坐标绘制标准工作曲线，计算线性方程和相关系数。对各组分质量浓度均为1 ng／mL 的混合标准溶液进行测定，以3 倍信噪比计算方法检出限。6 种硒形态的保留时间、线性范围、线性方程、相关系数及检出限见表2。由表2 可知，6 种硒形态在8 min 内均达到良好的分离（如图4 所示），且各形态硒的质量浓度在1～100 ng／mL 范围内与响应强度线性关系良好，相关系数均大于0.999，检出限为0.097 2～0.166 0 ng／mL。

表2 6 种硒形态保留时间、线性范围、线性方程、相关系数及检出限

图4 6 种硒形态分离色谱图（20 ng／mL 混合标准溶液）

2.4 精密度试验

在普通饮用水样品中添加质量浓度为2 ng／mL 的6 种硒形态混合标准溶液，按1.4 方法进行样品处理，在1.3 仪器工作条件下平行测定7 次，结果见表3。由表3 可知，6 种形态硒测定结果的相对标准偏差为5.65%～7.13%，表明该方法具有较高的精密度。

表3 精密度试验结果

2.5 加标回收试验

采用所建方法对富硒矿泉水及普通饮用水进行加标回收试验，测定结果见表4。由表4 可知，富硒矿泉水及普通饮用水中6 种硒形态化合物的加标回收率为74.6%～97.5%，表明该方法准确度较高，满足测定要求。

3 结语

建立了高效液相色谱–电感耦合等离子体质谱法测定水样中6 种硒形态的方法。采用O2作为碰撞反应气减小干扰，8 min 内可实现各硒形态的良好分离和准确测定。该方法可为食品样品中硒形态的准确分析提供参考。

表4 加标回收试验结果