银腺杨84K茎段瞬时转化体系的建立*

李晓军 安 轶 黄李超 曾 为 卢孟柱

(浙江农林大学林业与生物技术学院 省部共建亚热带森林培育国家重点实验室 杭州 311300)

杨树(Populus)是主要造林树种之一，是目前再生生物资源和森林碳汇的重要组分，具有重要的经济和生态价值。另外，杨树生长快、适应性强、成材早、木材蓄积量大，且遗传背景丰富、易于无性化扩繁和遗传转化，成为木本植物研究的模式物种(Janssonetal.， 2007； Polleetal.， 2013)。随着毛果杨(Populustrichocarpa)、胡杨(P.euphratica)、新疆杨(P.bolleana)、银腺杨84K(P.alba×P.glandulosa‘84K’)全基因组测序的完成(Tuskanetal., 2006; Maetal., 2013; 2019; Huangetal., 2020)，为杨树这一木本模式植物功能基因组的研究提供了基础。对木本植物来说，高大的树体需要庞大的维管组织来支撑，同时运输水分和营养物质。木材就是这些庞大的维管组织的产物，来源于维管形成层的活动。所以了解维管形成层活动的调控机制及木质部的分化是利用现代生物技术对木材材性进行遗传改良的基础。但获得稳定转基因植株的效率低、周期长，这些限制阻碍了对木本植物木材相关基因功能的大规模高效率鉴定。因此，建立一种快速、便捷、高效的方法，用以揭示木材形成分子机制，变得尤为重要。

瞬时转化技术可以避开冗长的转基因过程，只需将目的基因导入组织或个体，不涉及再生过程，转化之后直接进行基因表达分析或表型鉴定，具有操作简单、周期短、通量高的优点，可作为稳定转化的补充，特别适合应用于植物自身或异源基因功能及代谢途径的大规模遗传研究，并且可对无性繁殖困难的木本植株及同源植物系统(Korolevaetal., 2005; Yooetal., 2007)进行基因功能分析。近年来已有木本植物建立了瞬时转化体系，用于品种的选育与开发，基因枪转化(Nowaketal., 2004; Fizreeetal., 2019)、PEG介导原生质体转化(Yooetal., 2007)、植物病毒载体介导转化(Kumagaietal., 1995)和基于农杆菌(Agrobacterium)介导(Yangetal., 2000; Simmonsetal., 2009)的转化方法已成功应用于梨(Pyruscommunis)(Spolaoreetal., 2001)、甜橙(Citrussinensis)(de Oliveiraetal., 2009)、白桦(Betulaplatyphylla)、刚毛柽柳(Tamarixhispida)、黄檗(Phellodendronamurense)(Zhengetal., 2012)、桑(Morusalba)(Wuetal., 2015)、桂花(Osmanthusfragrans)(Hanetal., 2016)、柿(Diospyroskaki)(Moetal., 2019)、苹果(Malusdomestica)(Lvetal., 2019)等。在杨树中，通过PEG介导法成功获得了瞬时转化的叶片原生质体(Tanetal., 2013; Guoetal., 2015)； 通过基因枪转化法成功获得了瞬时转化的叶片表皮细胞和保卫细胞(Nowaketal., 2004)； 通过农杆菌侵染技术获得了瞬时转化的叶片(Takataetal., 2012)和芽(Yangetal., 2009)，这都为木本植物的基因调控研究提供了快速可靠的技术支持。

然而，上述瞬时转化技术只局限于原生质体、离体的叶片或芽，不利于研究木本植物形成层活动和木质部分化相关基因的功能。因此，本研究以银腺杨84K 1年生休眠茎段为材料，通过水培观察，表明其具有典型的形成层活动和木质部分化。以人工增强型绿色荧光蛋白(eYGFP)基因作为报告基因，建立农杆菌介导的真空渗透侵染茎段的转化体系，实现在形成层区域的外源基因表达，为木材形成和生长发育相关基因的研究提供了一种快速、高效的转化方法，以促进木本植物木材形成机制的研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

于2019年11月，在河北任丘中国林业科学研究院林业研究所试验基地，采集1年生银腺杨无性系84K休眠期枝条。截取直径约1 cm、长度约10 cm的茎段，封口膜包裹茎段两端以防止失水，并低温(4 ℃)保存。

1.2 载体构建和根癌农杆菌转化及鉴定

构建表达载体pK2GW7-eYGFP。首先根据Chin等(2018)所用载体克隆eYGFP表达序列35S-COR47-5′-UTR-eYGFP-HSP-T878(1 991 bp)，并通过酶切位点StuⅠ，使用同源重组方法将此序列构建到pK2GW7载体中(pK2GW7载体由浙江农林大学韩潇博士惠赠)。引物为F1(5′-CTGACCCACAGA TGGTTAGAGAGGTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAAT TT-3′)和R1(5′-GATGAGACCTGCCGCGTAGGTG TGTACAGATATATGTTGAATTATTGA-3′)。转化大肠杆菌(Escherichiacoli)后，在含壮观霉素(50 mg·L-1)的LB固体培养基中培养12 h，挑选阳性单克隆进行PCR鉴定。鉴定引物为F2(5′-CAGATGGTTAGAGAGGTGAGACTTTT-3′)和R2(5′-GACCTGCCGCGTAGGTGTGTACAGATAT-3′)。鉴定成功后提取质粒并利用冻融法将表达载体转化至根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101感受态细胞中，并PCR鉴定。表达载体pK2GW7转化至根癌农杆菌GV3101感受态细胞用于试验对照。

1.3 形成层活动的观察

将休眠茎段从低温环境取出，将其垂直培养在水中。对水培0、5、10、15、20、25、30天的茎段1/2处进行切片(40 μm，LEICA VT1200S)、20倍数显微镜下观察形成层活动(LEICA DM6)。培养条件为： 16 h光照/8 h黑暗，23～25 ℃，光照强度50 μmol·m-2s-1。

1.4 遗传转化操作

采用冻融转化法，将pK2GW7质粒和含eYGFP基因的双元载体pK2GW7的质粒转入农杆菌GV3101，然后将农杆菌于固体LB培养基(50 mg·L-1壮观霉素)上培养2天，培养温度为28 ℃。挑取单克隆进行PCR检测。检测正确后按1∶100(V/V)的比例取活化菌液接种于200 mL YEB液体培养基(50 mg·L-1利福平和50 mg·L-1壮观霉素)中，并置于28 ℃、200 r·min-1摇床内过夜，摇菌至OD600= 0.8。分别对不带载体、带有pK2GW7、带有pK2GW7-eYGFP的3种GV3101农杆菌菌液，在激光共聚焦显微镜(ZEISS，LSM 880)下观察，均未发现任何信号，故排除农杆菌本底表达的影响。收集pK2GW7、pK2GW7-eYGFP菌体，菌体用重悬液(1/2MS，25 g·L-1蔗糖，10 mmol·L-1MES， 200 μmol·L-1AS，pH5.6)重悬。转化前将低温保存的84K杨茎段在含25%蔗糖的1/2 MS溶液中浸泡3 h，可促进转化(Zhengetal., 2012)。将浸泡过的茎段竖直放入装有重悬液的三角瓶中，茎段形态学下端浸入重悬液中，形态学上端与真空仪器通过橡胶管连接，在0.08 MPa压强下，悬浮液从茎段形态学下端抽滤至形态学上端，转化完毕的茎段进行水培，培养条件为： 16 h光照/8 h黑暗，23～25 ℃，光照强度50 μmol·m-2s-1。

1.5 农杆菌介导的银腺杨84K茎段瞬时转化单因素试验

根据杨树遗传转化体系(Hanetal., 2000； Anetal., 2020)和桂花、朱槿(Hibiscusrosa-sinensis)、苹果、刚毛柽柳等其他木本植物遗传转化体系(Zhengetal., 2012； Trivellinietal., 2015； Hanetal., 2016； Lvetal., 2019)，本试验选择了影响农杆菌介导的84K杨茎段瞬时转化效率的转化因子进行研究： 乙酰丁香酮(AS)浓度、农杆菌浓度、真空渗透侵染时间、真空渗透侵染次数、侵染后培养时间。所有因子均设某单一因素为变量进行筛选，以报告基因eYGFP瞬时表达反映各因素对瞬时转化率的影响(瞬时转化率 = 观察到eYGFP绿色荧光信号的茎段数目/总转化茎段数目)，每个处理3次重复，每个重复至少6个茎段(P< 0.05； ANOVA)。

1.6 农杆菌介导的银腺杨84K茎段瞬时转化因子正交试验设计

为探究不同因素对84K杨茎段瞬时转化的相互影响作用，本试验进行了不同因素正交试验以选择最优的因子组合。以eYGFP瞬时转化率为考察指标，采用L9(34)正交试验进行试验设计(表1)。正交试验每个处理3次重复，每个重复至少6个茎段。采用SPSS17.0软件对数据进行分析。

1.7 银腺杨84K茎段瞬时转化效率分析

转化后的84K杨茎段可用LUYOR-3415RC手持荧光灯进行eYGFP初步观察分析。在茎段1/2处进行切片，切片厚度为40 μm，并使用共聚焦显微镜(ZEISS，LSM 880)在493～558 nm的蓝色激发光下观察荧光信号。统计观察到的eYGFP荧光信号，计算瞬时转化率。

2 结果与分析

2.1 解除休眠后茎段形成层的活动及木质部分化

对休眠的茎段进行水培。如图1A所示，培养0天时，形成层排列紧密，呈皱缩状； 随着培养天数增加，第5天时的形成层细胞吸水逐渐恢复扁平状态，形成层宽度和层数较0天时变化不显著(图1B、C)； 培养10天时，形成层层数显著增加，宽度增加不显著； 培养15天时，可观察到新形成的次生木质部，相较之前形成的木质部细胞，其细胞壁较薄。其中可见体积膨大的细胞，为新形成的导管。随着培养天数增加，新形成的次生木质部区域逐渐增加，并伴随着大量新导管产生。培养20～30天期间，形成层宽度增加显著，层数为5或6层。这表明1个月内水培休眠枝条可以模拟正常木材形成过程，新生的木质部细胞与前期形成的木质部没有显著差异。

2.2 载体构建及农杆菌转化鉴定

为建立银腺杨84K茎段瞬时转化系统，根据Chin 等(2018)所用载体克隆增强型eYGFP表达序列。将扩增产物通过同源重组方法连接到pK2GW7载体中，质粒转入农杆菌感受态GV3101中待用。pK2GW7-eYGFP载体如图2所示。

图1 室温水培解除休眠后茎段形成层的活动和木质部分化Fig. 1 Cambium activity and xylem differentiation of dormancy-released stem segments cultured in water at room temperature A： 不同培养天数形成层变化。CZ： 形成层； P： 韧皮部； Pf： 韧皮纤维； r： 射线； V： 导管； X： 木质部。红框代表新形成的次生木质部； 箭头代表新形成的导管。标尺为100 μm。A: Changes of cambium zone following cultured days. CZ: Cambium zone; P: Phloem; Pf: Phloem fibre; r: Ray; V: Vessel; X: Xylem. Red rectangles indicate the newly secondary xylem; Arrowheads point to new vessels. Scale bars: 100 μm. B, C: P < 0.05; one-way ANOVA.下同。The same below.

图2 pK2GW7-eYGFP表达载体示意Fig. 2 Schematic diagram of the pK2GW7-eYGFP vector

2.3 不同因素对84K杨茎段转化的影响

2.3.1 乙酰丁香酮(AS)对eYGFP基因瞬时转化率的影响 添加AS与不添加AS相比，eYGFP基因瞬时转化效率明显增加。当AS浓度为100、200、300 μmol·L-1时，转化效率无显著变化(图3A)。故添加AS进行后续试验，选择AS浓度为200 μmol·L-1。

2.3.2 菌液浓度对eYGFP基因瞬时转化率的影响 农杆菌浓度OD600为0.3时瞬时转化eYGFP基因成功率最低，随着农杆菌浓度增加，转化率增加； 当农杆菌浓度OD600增加到0.9时，瞬时转化效率达到最高。随着农杆菌浓度提高到1.2或1.5时，转化效率降低(图3B)。说明菌液浓度过高或过低均会影响转化效率。农杆菌浓度过高，加快了茎段的腐烂速度，导致茎段生理状态较差从而影响转化率。

2.3.3 真空渗透侵染时间对eYGFP基因瞬时转化率的影响 如图3C所示，瞬时转化率在真空渗透侵染时间5～15 min时较低，在达到20 min时显著增加，在延长到30 min时反而下降。表明，真空渗透侵染达到一定时间后处于侵染饱和状态，抽吸时间过长反而引起茎段结构损伤，影响转化率。

2.3.4 真空渗透侵染次数对eYGFP基因瞬时转化率的影响 随着真空渗透侵染次数增加(每2次真空渗透侵染间隔72 h)，转化率呈现出先增后降的趋势。当用农杆菌重悬液真空渗透侵染2次时，瞬时转化率最高； 减少或增加真空渗透侵染次数，转化率未显著增加； 且当真空渗透侵染5次时瞬时转化率最低(图3D)。表明真空渗透侵染会不同程度地损伤茎段，抽吸次数越多损伤越大，导致转化率越低。

2.3.5 培养天数对eYGFP基因瞬时表达的影响 真空渗透侵染后，将茎段进行水培。水培天数对瞬时转化率也有较大影响(图3E)。当水培天数较短时，如3天和6天，均观察不到绿色荧光信号； 当培养到第9天时，可观察到绿色荧光； 水培至12天时瞬时转化率最高。随后，随培养时间增加，转化率降低。

图3 不同因素对84K杨茎段真空渗透转化的影响Fig. 3 Effects of key factors on transient transformation of poplar 84K stem segments via vacuum infiltration

2.4 农杆菌介导的84K杨茎段瞬时转化体系的优化

为优化农杆菌介导的84K杨茎段瞬时转化效率，根据上述单因素试验结果，通过L9(34)的正交试验设计(表1)，共进行了9组不同水平处理的转化因子组合试验。表明水培天数、真空渗透侵染时间均对eYGFP瞬时转化率有显著影响(P< 0.05)，即水培天数和真空渗透侵染时间显著影响农杆菌介导银腺杨84K茎段瞬时转化率，而菌液浓度和真空渗透侵染次数的影响不显著(表2)。4个因素对转化率的影响为： 侵染后水培天数>真空渗透侵染时间>菌液浓度>真空渗透侵染次数。

通过表1显示，农杆菌介导的真空渗透瞬时转化银腺杨84K茎段的最优组合是农杆菌重悬液浓度为OD600= 0.9、真空渗透侵染20 min、真空渗透侵染2次、侵染后水培15天。

2.5 瞬时转化后eYGFP的表达观察

瞬时转化后进行水培，经切片显微观察，维管组织发育情况与休眠茎段水培的维管组织发育情况类似。形成层细胞从最初的皱缩状恢复到扁平状，形成层层数也随之增加，培养15天可观察到新形成的次生木质部细胞。瞬时转化后的茎段维管发育也可追踪从形成层活动到木质部形成的全过程。84K杨茎段瞬时转化后水培15天时的eYGFP表达情况初步观察如图4所示。图4A为正常光下茎段整体情况，茎段下部剥掉部分树皮，露出形成层区域。经激发光照射在已转化的茎段形成层区域可观察到eYGFP绿色荧光信号(图4B中红箭头所示)，红色为自发荧光。正常光下茎段横截面如图4C所示，照射激发光后在茎段横截面上也可观察到明显的eYGFP绿色荧光信号(图4D)。

表1 84K杨茎段瞬时转化因子L9 (34)正交试验设计(均值±标准误)Tab.1 Factors and levels of L9 (34) orthogonal experiments(Mean ± SE)

图5 瞬时转化后eYGFP在不同部位的表达情况Fig. 5 eYGFP expression in different regions A： 周皮(Pd)、皮层(Co)、韧皮部(Ph)； B： 形成层区域(CZ)； C： 木质部(Xy)； D： 髓(Pi)； E： 髓射线(PiR)。标尺= 50 μm。A: Periderm(Pd), Cortex(Co), and Phloem(Ph); B: Cambium zone(CZ); C: Xylem(Xy); D: Pith(Pi); E: Pith rays(PiR). Scale bars = 50 μm.

为进一步探究84K杨茎段转化后eYGFP绿色荧光信号具体部位，对茎段1/2处进行切片观察。通过共聚焦显微镜观察不同部位eYGFP的表达情况，在周皮、皮层、韧皮部、木质部、髓中未观察到绿色荧光信号(图5A、C、D)。而在形成层区域细胞中可观察到较多的绿色荧光信号(图5B)，同时在髓射线中也可观察到较少的微弱荧光信号(图5E)。结果显示瞬时转化后eYGFP的表达主要集中在形成层区域。说明外源基因可以在形成层细胞中表达，有利于鉴定它们在形成层活动及分化为木质部中的作用。

3 讨论

现代生物技术的迅猛发展已推动林木研究从传统育种转向分子育种，而利用现代生物技术对木材进行遗传改良，首先必须了解木材形成的复杂过程。目前，研究木本植物的木材相关基因大多以稳定的遗传转化植株为材料。稳定遗传转化技术需要把目的基因整合到宿主基因组中，使宿主具有目的基因所表现的性状、功能和表型。多数稳定的农杆菌介导转化需要再生体系，这是一个繁琐且漫长的过程。由于木本植物具有杂合性高、繁殖时间长、转化效率低等特点，不能快速获得大量转基因植株，且仍有相当一大部分木本植物再生体系没有建立，遗传改良受到限制(Gambinoetal., 2012； van Nockeretal., 2014)。与稳定遗传转化体系相比，瞬时转化技术不涉及再生过程，可在转化之后直接进行表型鉴定，周期短且转化效率高(Uenoetal., 1996)。然而，瞬时转化大多以叶片(Tanetal., 2013; Guoetal., 2015)为转化材料，虽转化体系较为成熟，但转化过程损坏了转化材料使其无法继续正常生长。而且由于转化材料组织的限制，更不利于木本植物木材发育相关基因的研究。

本试验在不破坏植物材料的前提下，通过真空渗透侵染的方法建立了农杆菌介导的银腺杨84K茎段瞬时转化体系。试验通过研究菌液浓度、真空渗透侵染时间、真空渗透侵染次数、侵染后水培天数等转化因子，采用正交设计优化试验，结果表明真空渗透侵染时间和水培天数对eYGFP瞬时转化率有显著影响。真空渗透侵染方法通过真空压力将农杆菌菌液从茎段下端抽至茎段上端，此操作方便快捷且可批量转化。此方法增加了84K杨茎段导管的运输能力和细胞的渗透性，使载体更容易进入植物细胞。切片观察结果表明eYGFP报告基因主要在恢复活力的形成层区域中表达(图5)。说明相较于其他的叶或芽等材料的瞬时转化体系，本体系能提供形成层细胞相关基因的原位表达，这都有利于鉴定它们在形成层活动方面的作用。试验结果表明，侵染后水培9～20天后目标基因的表达水平都较高(图3E)，农杆菌转化后直接进行水培，15天之前休眠茎段的主要活动是形成层恢复活力，形成层层数和宽度都有所增加。如果研究的目标基因参与形成层细胞活动，则可在15天之前进行形成层细胞的早期表型变化观察。而15天左右可观察到新形成的次生木质部。因此研究木质部发育相关基因的功能，可在15天后再进行维管组织发育的表型变化观察。本体系的建立可以追踪木质部形成的全过程，所以可利用它研究形成层及木质部发育的相关基因功能，但需要注意观察分析时间。

建立高效的瞬时表达系统，有助于植物基因功能的研究。本体系在不破坏植物材料的基础上，可快速、便捷、高效地获得瞬时转化材料，特别有助于研究维管组织发育相关基因。此方法建立对揭示木材形成的分子机制有重要意义，同时也可为研究其他木本植物木材形成相关基因提供借鉴。

4 结论

本研究建立了银腺杨84K茎段真空渗透瞬时转化体系： 农杆菌重悬液OD600为0.9，抽真空20 min，根癌农杆菌真空渗透侵染2次，水培15天。外源基因主要在银腺杨84K茎段形成层细胞中表达，可以快速鉴定其在维管组织分化中的功能，有助于研究木质部发育的调控机制，也可为其他木本植物的木材品质研究提供新思路。