超声造影早期检出联合间充质干细胞治疗改善肝移植术后胆道缺血预后的初步探讨

林跃君 郑博文 吴涛 周慧超 廖梅 吕艳 何玉婷 任杰

非吻合口胆管狭窄（non-anastomotic biliary stricture，NAS）是肝移植术后最为棘手的胆道并发症，发生率达5%～30%，是导致移植物失功及二次移植的主要原因[1-2]。目前NAS的治疗方法包括内镜逆行胰胆管成像（endoscopic retrograde cholangiopancreatography，ERCP）、经皮经肝胆管引流术（percutaneous transhepatic cholangial drainage，PTCD）、胆肠吻合术等，但以上手段仅为对症治疗，二次移植往往是大多数受者最终的根治手段[3-6]。究其原因，可能是NAS的确诊依赖于影像学提示胆管出现非吻合口处的多发狭窄、扩张等不可逆性形态学改变，而此时治疗为时已晚。若能在胆管树出现形态改变之前早期诊治，则可能有望解决这一难题。

胆管周围血管丛损伤导致的胆道缺血是肝移植术后发生NAS的主要危险因素之一，也是其重要的病理改变[7-8]。超声造影（contrast-enhanced ultrasound，CEUS）可动态描绘肝门部胆管微循环灌注情况，并可用于定性诊断胆道缺血及NAS[9-10]。间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）具有促进血管生成、抗炎、免疫调节等功能，已有其应用于治疗缺血性损伤的研究报道[11-14]。若在胆管出现严重形态学改变前，应用CEUS早期检出胆道缺血，并及时进行MSC治疗，能否改善甚至逆转NAS的不良预后？目前尚无相关研究。本研究回顾性分析肝移植术后4周内应用CEUS早期检出胆道缺血并应用MSC治疗受者的长期预后，以初步探讨MSC早期治疗NAS的可行性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2012年9月至2015年12月在中山大学附属第三医院行肝移植且术后发生胆道缺血的9例受者的临床资料。其中MSC治疗组5例，男4例，女1例，年龄43（38，56）岁，原发病包括原发性肝癌（肝癌）2例、乙型病毒性肝炎肝硬化1例、慢性重型肝炎1例、肝恶性肿瘤（性质不明）1例。常规治疗组4例，均为男性，年龄53（48，61）岁，原发病包括乙型病毒性肝炎肝硬化2例、肝癌1例、丙型病毒性肝炎肝硬化1例。本研究通过医院伦理委员会审核，患者均签署知情同意书。

纳入标准：（1）术后4周内CEUS提示胆道缺血（动脉期胆管壁无增强）[15]；（2）术后1年内磁共振胰胆管成像（magnetic resonance cholangiopancreatography，MRCP）、ERCP或 PTCD确诊 NAS。排除标准：（1）因原发性硬化性胆管炎接受肝移植；（2）因CEUS禁忌证无法行CEUS检查；（3）肝移植术后1周内死亡；（4）确诊NAS前死亡；（5）确诊NAS前诊断肝动脉血栓、移植物失功或肝癌复发。

1.2 治疗方法

常规治疗组仅行常规治疗，治疗方式包括护肝、利胆、介入治疗等。MSC治疗组在常规治疗的基础上，分别于CEUS提示胆道缺血后1、2、4、8、12和16周接受MSC静脉输注，每次输注1.0 × 106/kg人脐带MSC（悬浮于100 mL生理盐水）。脐带的处理，MSC的提取、扩增和鉴定均在中山大学附属第三医院细胞基因治疗及临床转化研究中心完成[16]。

1.3 检查方法

CEUS检查于肝移植术后4周内进行。超声仪采用Siemens Sequoia 512（美国），Toshiba Aplio 500（日本），选择3.5～5.0 MHz凸阵探头，选择低机械指数的实时造影模式。使用声诺维（SonoVue）造影剂（意大利Bracco公司），按说明书配置5 mL造影剂混悬液，经肘静脉团注1.5 mL。观察肝门部及左右肝管汇合部，评估胆管血供情况。获取持续6 min的CEUS录像[9]。记录CEUS动脉期、门静脉期和延迟期胆管壁的增强情况（无增强、低增强、等增强、高增强），定义动脉期胆管壁无增强为胆道缺血[15]。

在出现黄疸、胆管炎、γ-谷氨酰转移酶水平升高时采用MRCP、ERCP或PTCD确诊NAS，NAS的诊断标准为出现移植肝内外胆管非吻合口狭窄、扩张、形态异常，且无肝动脉栓塞。

1.4 研究内容

所有受者随访时间截止至术后1年。分析两组受者术后1年内接受介入治疗的情况，包括干预的首次时间和干预次数。分析两组受者的预后，包括移植物失功及弥漫性胆管损伤的发生情况，其中弥漫性胆管损伤定义为多发肝内胆管狭窄、胆管扩张、肝脓肿及胆瘘。

2 结 果

2.1 两组受者术后1年内介入治疗情况分析

MSC治疗组仅2例受者需接受介入治疗，首次治疗时间为肝移植术后7～9个月，治疗次数1～2次；常规治疗组所有受者均需接受介入治疗，首次治疗时间早于MSC治疗组，为术后1～3个月，治疗次数2～6次。两组典型病例的治疗前后影像学检查结果见图1、2。治疗前，CEUS均提示胆道缺血。肝移植术后1年，MRCP提示MSC治疗组受者未见肝内胆管狭窄，而PTCD提示常规治疗组受者出现多发肝内胆管狭窄。

图1 1例肝移植术后CEUS提示胆道缺血接受常规治疗受者的超声表现Figure 1 Ultrasonic findings of 1 recipient received conventional treatment with biliary ischemia determined by CEUS after liver transplantation

图2 1例肝移植术后CEUS提示胆道缺血且接受MSC治疗受者的超声表现Figure 2 Ultrasonic findings of 1 recipient received MSC treatment with biliary ischemia determined by CEUS after liver transplantation

2.2 两组受者的预后情况分析

MSC治疗组受者在MSC输注期间未出现发热、过敏、机会性感染等不良反应。肝移植术后1年内，MSC治疗组2例受者发生弥漫性胆管损伤，未发生移植物失功；常规治疗组所有受者均发生弥漫性胆管损伤，2例受者发生移植物失功。

3 讨 论

各种原因导致的胆道缺血是NAS的病因之一，胆管形态学的改变往往继发于胆道缺血[17]。目前NAS的确诊依赖于影像学检查发现胆管形态学改变，而这一过程时间较长。蔡晓波等[18]和汪邵平等[19]报道NAS的确诊时间为肝移植术后4.5个月和4.9个月。此时胆管形态学的改变往往已不可逆，受者可能早已错失最佳治疗时机。与检测胆管形态学改变相比，通过CEUS检测胆道缺血可更早预警NAS发生。有研究证实，CEUS不仅可用于检测肝门部胆管微循环灌注，还可用于诊断胆道缺血及NAS[15]。在本研究中，9例受者均在肝移植术后4周内通过CEUS检出胆道缺血，且术后1年内均确诊为NAS，提示CEUS可早在术后4周内即可对NAS的发生提出预警，临床应对此类受者进行早期干预。

目前对NAS的治疗，主要为介入治疗，但效果不佳[20-21]。Graziadei等[22]对19例肝移植术后NAS受者进行ERCP治疗，平均随访39.8个月，无受者获得完全缓解。Barbaro等[23]对33例肝移植术后NAS受者进行ERCP治疗，仅12例受者获得治疗成功和临床缓解。鉴于胆道缺血是NAS的病因之一，早期改善胆道缺血可能改善NAS的治疗效果。

研究表明，移植肝胆管上皮丢失是胆管并发症发生的病理基础。胆管上皮可在供给足够氧气、营养的条件下快速充分再生，但若胆管周围血管丛受损，不能给胆管上皮细胞提供足够支持，则导致胆管上皮细胞再生不良，出现持续性胆管上皮坏死、脱落、纤维化，从而导致胆管狭窄[7]。Hansen等[24]对93例供者供肝在再灌注后及重建胆管吻合前进行活组织检查，发现77例（83%）供肝伴显著胆管上皮丢失。Brunner等[25]对79例供者供肝的肝外胆管在器官获取和肝移植术中进行活组织检查，发现86%供肝伴胆管上皮丢失。

MSC是一类具有自我更新和多向分化潜能的非造血细胞，不仅具有免疫调节功能，还有促进血管生成及组织再生作用[10-11,26-27]。本研究初次应用MSC早期治疗肝移植术后CEUS提示为胆道缺血的受者。此时胆管并未现明显的形态学改变，利用MSC的抗炎和免疫抑制功能，一方面可有效缓解局部微环境的炎症反应，另一方面也可有效缓解胆管周围血管丛的损伤并促进上皮细胞的修复再生，缓解胆管上皮的坏死、脱落、瘢痕化，减慢胆管狭窄这一严重不良预后的进展。在本研究中，接受MSC治疗的受者均未发生移植物失功，需接受介入治疗的时间晚于常规治疗的受者，且次数较少，提示MSC治疗对改善肝移植受者的预后、提高生活质量有一定作用。但值得注意的是，MSC治疗并未逆转NAS的发生，着眼于多因素预防这一严重并发症的发生可能更为重要，比如减少冷缺血和热缺血时间、提高供肝质量、提高手术技术等。

综上所述，应用CEUS早期检出肝移植术后胆道缺血，并进行MSC治疗可能有效改善肝移植术后NAS受者的预后，这为NAS的早期诊治提供了潜在可能性。但MSC的最佳输注剂量、疗程、间隔时间等问题仍需进一步探讨，今后还需进行更大样本量的随机深入研究。