人脐带间充质干细胞通过线粒体转移减轻肝细胞缺血-再灌注损伤的机制研究

单佳柔 尼贝贝 李翠平 徐睿璇 陈文捷

肝缺血-再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）是指在肝移植过程中，阻断肝脏血流一段时间后，重新开放血流造成的损伤，其在临床肝移植手术中发生率较高，可造成术后一系列并发症如胆道、血管并发症等[1-2]，是导致肝移植术后受者生存率降低的主要因素。

人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cell，HUC-MSC）具有排斥性低、来源广泛、获取简便等优点，在免疫治疗方面有着非常广阔的应用前景[3]。既往研究中已有数据表明，间充质干细胞移植可改善肝功能，在多种肝脏疾病模型中都表现出了减轻肝脏损伤、降低炎症水平的作用，在临床研究中也表现出一定的疗效[4-6]。然而在不同的研究中，采用间充质干细胞治疗的细胞数量尚无定论。

近年来，研究者对于间充质干细胞基于线粒体的直接接触作用展开了一系列研究。目前研究表明，隧道纳米管（tunneling nanotube，TNT）是细胞间信息交流与物质传递的一种新渠道，线粒体可以通过这种方式进行转移，从而减轻器官损伤[7-10]。本研究通过氧糖剥夺（oxygen-glucose deprivation，OGD）的方式培养正常人肝细胞株L02建立IRI模型，并使用不同浓度的HUC-MSC干预，观察不同浓度HUC-MSC对肝细胞IRI的直接作用，以期为优化临床肝移植术后的缺血并发症治疗方案提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

正常人肝细胞株L02为笔者实验室保存的细胞株。HUC-MSC来源于中山大学附属第三医院生物治疗中心，已通过干细胞质量检测，符合相关医学伦理学规定。

1.2 主要试剂和仪器

高糖Dulbecco改良的Eagle培养基（Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM）、无糖DMEM、胰酶、磷酸盐缓冲液均购自美国Gibco公司。胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自德国PAN公司。细胞凋亡试剂盒AnnixinV-APC/PI购自江苏凯基公司。人源碱性成纤维细胞生长因子购自美国PeproTech公司。CellTrace Violet、MitoSOX Red、MitoTracker Deep Red 均购自美国Thermo Fisher公司。Phaliodinifluor 488购自英国Abcam公司。

1.3 IRI模型建立和分组

通过OGD的方式进行细胞培养建立IRI模型。使用无糖无血清DMEM在低氧培养箱（1% O2，5%CO2）培养6 h后更换新鲜培养基（高糖DMEM+10%FBS）在正常培养箱（5% CO2）培养2 h。未建立IRI模型的细胞使用高糖DMEM+10%FBS在正常培养箱中培养6 h后，更换新鲜培养基培养2 h。

细胞分组：将L02分为空白对照组、OGD组、实验对照组和L02与HUC-MSC共培养组（L02+HUC-MSC组）。其中L02+HUC-MSC组将L02与HUC-MSC根据不同比例共培养，分为10:1共培养组（A组）、4:1共培养组（B组）、2:1共培养组（C组）、1:1共培养组（D组）和1:2共培养组（E组）。空白对照组为L02单独培养未建立IRI模型。OGD组为L02单独培养建立IRI模型。实验对照组为L02与HUC-MSC按照1:1的比例直接共培养12 h，未建立IRI模型。L02+HUC-MSC组中，将L02与HUC-MSC按照上述不同比例直接共培养12 h后，建立IRI模型。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞内活性氧簇相对量和细胞凋亡率检测 空白对照组、OGD组及A～E组细胞采用细胞膜染料CellTrace Violet标记L02，染色结束后洗去染料正常培养12 h，再与未标记的HUC-MSC按照不同比例直接共培养后，采用流式细胞术分析。按照试剂盒使用说明书，各组细胞分别用MitoSOX Red、Annexin V-APC/PI孵育，以检测细胞内活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）相对量及细胞凋亡率。

1.4.2 细胞间线粒体转移检测 实验对照组和A～E组细胞分别采用CellTrace Violet标记L02和线粒体靶向染料MitoTracker Deep Red标记HUC-MSC，染色结束后洗去染料正常培养12 h，再按照不同比例直接共培养后，采用流式细胞术测定L02的MitoTracker阳性率。

1.4.3 激光共聚焦显微镜观察细胞间线粒体转移Phalloidin-ifluor 488是F-actin的一种特异性染料，用Phaliodin-ifluor 488对共培养细胞进行染色可使含有F-actin的TNT发出绿色荧光。采用激光共聚焦显微镜（德国ZEISS公司）观察C组HUC-MSC与L02细胞间线粒体转移情况。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析；采用GraphPad Prism 5软件进行绘图分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HUC-MSC对L02细胞凋亡和细胞内ROS的影响

将CellTrace Violet标记的L02与未标记的HUC-MSC直接共培养后，采用流式细胞术分析，CellTrace Violet阳性为L02，CellTrace Violet阴性为HUC-MSC（图1A）。各组L02细胞凋亡率见图1B。OGD组L02细胞凋亡率为59%，高于空白对照组的5%（P＜0.05）。将L02与HUC-MSC直接共培养后，L02细胞凋亡率降低，A、B、C组L02细胞凋亡率分别为50%、43%、37%，与OGD组比较，B组和C组L02细胞凋亡率降低，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）；而继续升高HUC-MSC的比例，L02细胞凋亡率逐渐升高，D组和E组L02细胞凋亡率分别为42%和47%，但仍低于OGD组（均为P＜0.05）。各组L02细胞内ROS相对量见图1C。OGD组L02细胞内ROS相对量较空白对照组升高（P＜0.05），将L02与HUC-MSC直接共培养后，E组L02细胞内ROS相对量较OGD组降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 各组L02细胞凋亡率和细胞内ROS相对量的比较Figure 1 Comparison of cell apoptosis rate and intracellular relative ROS level of L02 cells among each group

2.2 HUC-MSC向L02转移线粒体的流式细胞学表现

将L02用CellTrace Violet标记，HUC-MSC用线粒体靶向染料MitoTracker Deep Red标记，采用流式细胞术分析，CellTrace Violet阳性为L02，MitoTracker阳性为HUC-MSC（图2A）。HUC-MSC 向L02转移线粒体的情况见图2B、C。A组 L02的MitoTracker阳性率为31%，与实验对照组（30%）比较差异无统计学意义（P＞0.05）；继续升高HUC-MSC的比例，B、C、D、E组L02的MitoTracker阳性率均较实验对照组增加（均为P＜0.05），B、C、D组分别为46%、71%、91%，E组中几乎全部L02都表现出MitoTracker阳性。结果表明在IRI刺激下，线粒体会大量从HUC-MSC转移到L02，并呈浓度依赖性。

图2 HUC-MSC 向L02转移线粒体的流式细胞学表现Figure 2 Flow cytometry findings of mitochondrial transfer from HUC-MSC to L02 cells

2.3 HUC-MSC向L02转移线粒体的激光共聚焦显微镜下表现

采用MitoTracker Deep Red标记HUC-MSC（图3A），CellTrace Violet标记L02（图3B），再用Phaliodinifluor 488对共培养细胞进行染色（图3C），激光共聚焦显微镜下可见包含HUC-MSC线粒体的TNT状结构连接HUC-MSC和L02，有红色的线粒体通过并存在于两种细胞中（图3D、E）。结果揭示了HUCMSC和L02细胞骨架之间的联系，进一步证实了线粒体从HUC-MSC转移至L02。

图3 HUC-MSC向L02转移线粒体的激光共聚焦显微镜下表现Figure 3 Mitochondrial transfer from HUC-MSC to L02 cells under the confocal laser scanning microscopy

3 讨 论

肝脏IRI过程中发生的氧化应激及炎症反应等会损害肝功能，造成局部出血、坏死。在缺血阶段，肝窦内皮细胞首先受到影响，被诱导发生程序性细胞死亡，由此导致了肝脏内血窦结构破坏和血栓形成，从而引发一系列免疫损伤[11-13]。再灌注阶段造成的损伤更为严重，肝脏固有免疫应答被激活，诱导中性粒细胞浸润并协同枯否细胞共同发挥损伤作用[14-15]。干细胞移植在缺血性疾病中表现出了一定的治疗效果，已有研究表明HUC-MSC来源的外泌体和细胞外囊泡可通过降低氧化应激水平，减轻中性粒细胞浸润来缓解大鼠肝脏IRI[16-17]。从HUC-MSC中分离的线粒体可在一定程度上恢复局部缺血所致脑卒中小鼠的运动机能[18]。Bi等[19]研究表明间充质干细胞可延缓小鼠肝脏纤维化的进展，对终末期肝硬化起到了一定的治疗作用。在相关的临床试验中亦发现，注射自体骨髓间充质干细胞可恢复患者肝功能和减轻肝脏纤维化程度[20-21]。

本研究通过OGD的方式培养L02建立IRI模型，通过HUC-MSC和L02体外直接共培养来探究不同浓度HUC-MSC对肝细胞IRI的作用。在L02+HUCMSC共培养组中，随着HUC-MSC浓度升高，L02细胞凋亡率下降，L02与HUC-MSC共培养比例2:1时，HUC-MSC减轻L02细胞凋亡的作用最佳，细胞凋亡率为37%；而在L02与HUC-MSC共培养比例为1:2的情况下，细胞凋亡率为47%（P＜0.05）。表明在HUC-MSC的损伤修复作用中，细胞移植浓度是一个关键影响因素。

线粒体是组织损伤，尤其是IRI的一个重要靶点[22-24]。Gu等[25]的研究表明在IRI期间，线粒体自噬在线粒体功能和肝细胞存活中发挥了关键作用。在IRI过程中，细胞内ROS大量累积，产生离子交换异常，导致线粒体功能下降甚至线粒体破裂[26-28]。本研究中，IRI后的L02细胞内ROS相对量较对照组升高（P＜0.05），L02和HUC-MSC直接共培养后低浓度HUC-MSC条件下ROS相对量变化较小，而升高HUC-MSC浓度，共培养比例1:2时HUC-MSC才起到了降低ROS相对量的作用（P＜0.05）。HUC-MSC降低氧化应激产生的ROS水平相对有限，Johnson等[29]提出在治疗慢性阻塞性肺疾病方面，无靶向性的抗氧化剂（例如N-乙酰半胱氨酸）的临床功效有限。Li等[30]的研究发现诱导多能干细胞来源的间充质干细胞（induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cell，iPSC-MSC）可以通过线粒体转移的方式减轻气道损伤及炎症反应，但iPSC-MSC对损伤细胞内ROS水平的调节作用有限。说明HUCMSC的保护作用可能不是通过一般的抗氧化作用，而是通过向受损细胞转移线粒体，特异性恢复线粒体功能，改善细胞生理状态。本研究观察到连接HUCMSC和L02的细胞骨架中TNT形成，TNT是高度敏感的纳米管结构，可促进囊泡和细胞器在细胞之间的选择性转移。IRI刺激后，线粒体从HUC-MSC向L02转移，随着HUC-MSC的浓度升高，线粒体的转移率也逐渐提高，在L02和HUC-MSC共培养比例1:1的情况下，90%以上的L02都表现出了HUCMSC线粒体阳性，结合HUC-MSC对L02细胞凋亡的保护作用，可认为其线粒体转移率在一定范围内与对L02细胞凋亡的保护作用呈正相关。

综上所述，HUC-MSC可通过细胞间直接转移线粒体的方式减轻IRI后L02细胞凋亡和降低细胞内ROS水平，不同浓度HUC-MSC对肝细胞IRI的直接保护作用有所差异，呈一定的浓度依赖性。关于HUC-MSC浓度对损伤修复作用的影响机制有待进一步探讨。