肌腱蛋白-C在肝移植术后早期急性排斥反应中的作用

曹薇薇 杨佩军 李霄

随着外科技术的发展，肝移植成为治疗终末期肝病的唯一有效手段，但是肝移植术后缺血-再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）和急性排斥反应（acute rejection，AR）引起的早期移植物损伤仍是困扰临床肝移植工作者的主要问题[1-3]。肝移植术后AR是由T细胞介导的排斥反应，以肝实质内炎症细胞浸润、静脉内皮和胆管损伤为主要特征[4]。传统免疫抑制剂的使用可在一定程度上降低AR的发生率，但其导致的一系列并发症如原发性肝癌（肝癌）复发、术后感染、药物性肝损伤等，严重影响受者的生存质量[5-7]。此外，如处理不当，AR可发展为慢性排斥反应，严重影响移植肝的功能与受者的长期生存[8]。因此，寻找肝移植术后早期AR的标志性分子和进一步探讨早期移植物损伤的潜在机制并开发新的治疗靶点迫在眉睫[9-10]。

肌腱蛋白-C（tenascin-C，TNC）是细胞外基质中重要的寡聚糖蛋白，在肝IRI和炎症反应中常作为促炎因子发挥作用[11-12]。TNC具有复杂的生物功能，在健康成人肝脏内不表达，而在肝IRI、病毒性感染、炎症反应等病理生理过程中表达迅速上调，是肝损伤和炎症反应的重要分子标志物[11,13-14]。本研究检测了大鼠肝移植AR模型中TNC的表达情况，旨在探讨TNC与肝移植术后AR的关系，为AR所致肝损伤的早期诊断和治疗提供潜在靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

近交系Brown Norway（BN）大鼠（6只）、Lewis大鼠（16只）均购于北京维通利华公司，饲养于空军军医大学西京医院肝胆胰脾外科实验室无特定病原体（specific pathogen free, SPF）级动物房中，自由饮食。AR组选用Lewis大鼠（180～220 g）作为供体（6只），BN大鼠（200～240 g）作为受体（6只）；对照组选用Lewis大鼠（180～220 g）作为供体（5只），Lewis大鼠（200～240 g）作为受体（5只）。根据Kamada“二袖套法”在体视显微镜下行大鼠原位肝移植[15]。受体均于肝移植术后7 d取血清，处死后收集肝组织。每组3只受体用于病理学检查和免疫组织化学（免疫组化）染色。每组所有受体均用于蛋白质印迹法和酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immune absorbent assay，ELISA）。

1.2 主要试剂

大鼠TNC ELISA试剂盒（NBP2-78768）购于美国Novus Biologicals公 司，TNC一 抗（EPR4219）购于英国Abcam公司，β-actin一抗购于美国Cell Signaling Technology公司，磷酸酶抑制剂CocktailⅠ购于美国Sigma-Aldrich公司。

1.3 实验方法

1.3.1 病理学检查 采用苏木素-伊红（hematoxylineosin，HE）对大鼠肝移植术后7 d移植肝组织进行染色，采用Banff分级评估排斥活动指数（rejection activity index，RAI）评分，按照汇管区炎症、胆管损伤和静脉内皮损伤的严重程度进行评分（0～3分），评分之和为RAI[16]。

1.3.2 免疫组化染色 采用免疫组化染色检测大鼠肝移植术后7 d移植肝TNC蛋白的表达情况。一抗4 ℃冰箱孵育过夜[磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）代替一抗作阴性对照]，滴加生物素标记的二抗，37 ℃孵育30 min，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，37 ℃孵育30 min，3,3'-二氨基联苯胺（3,3'-diaminobenzidine，DAB）显色，苏木素复染，显微镜下观察并拍照，细胞核或细胞质染色呈棕褐色为阳性。

1.3.3 蛋白质印迹法 采用蛋白质印迹法检测大鼠肝移植术后7 d移植肝TNC蛋白的相对表达量。TNC一抗（1:1 000）、β-actin一抗（1:2 000）孵育过夜，加相应二抗（1:2 000）孵育2 h。采用Bio-Rad凝胶成像分析仪显色，采用Image J软件分析结果。

1.3.4 酶联免疫吸附试验 收集肝移植大鼠术后7 d血清，采用ELISA检测血清TNC的表达水平，并分析血清TNC表达水平与RAI评分的相关性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0 软件进行统计学分析。对于符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验；采用Pearson相关性分析评价大鼠血清TNC表达水平与RAI评分的关系。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠肝移植术后7 d移植肝组织病理学表现

大鼠肝移植术后7 d移植肝组织HE染色结果显示，AR组汇管区可见大量以淋巴细胞为主的炎症细胞浸润，累及汇管旁肝实质，静脉内皮周围可见大量炎症细胞浸润，所有胆管上皮周围均有炎症细胞浸润，少数胆管上皮出现局灶性管腔破坏，RAI评分5.0～9.0分；对照组汇管区少量炎症细胞浸润，胆管上皮和静脉内皮未累及，RAI评分1.0～3.0分（图1）。

图1 两组大鼠移植肝组织病理学表现（HE，×200）Figure 1 Pathological findings of liver allograft tissues of rats in two groups

2.2 大鼠肝移植术后7 d移植肝组织TNC的表达情况

免疫组化染色结果显示，肝移植术后7 d AR组大鼠移植肝组织细胞外基质中TNC阳性细胞分布多于对照组（图2）。蛋白质印迹法结果显示，肝移植术后7 d AR组大鼠移植肝组织中TNC蛋白相对表达量高于对照组（t=5.112，P=0.007，图3）。

图2 两组大鼠移植肝组织TNC阳性细胞分布情况（免疫组化，×200）Figure 2 Distribution of TNC positive cells of liver allograft tissues of rats in two groups

图3 两组大鼠移植肝组织TNC蛋白相对表达量Figure 3 Relative protein expression level of TNC of liver allograft tissues of rats in two groups

2.3 大鼠肝移植术后7 d血清TNC的表达水平

ELISA结果显示，肝移植术后7 d AR组大鼠血清TNC表达水平高于对照组（t=3.152，P=0.012，图4A）。相关性分析结果显示，血清TNC表达水平与RAI评分呈正相关（r=0.790 9，P=0.004，图4B）。

图4 两组大鼠肝移植术后血清TNC表达水平及与RAI评分的相关性Figure 4 Expression level of TNC in serum after liver transplantation and its correlation with RAI score of rats in two groups

3 讨 论

肝移植术后早期移植物损伤主要包括AR和IRI[17-18]。有研究表明，肝移植术后AR的发生率为40%～70%[19]。虽然肝移植术后早期AR不会对受者的长期预后造成影响，但是若未及时处理，AR可发展为慢性排斥反应，导致移植物失功甚至需二次肝移植[8]。AR诊断的金标准是移植物穿刺活组织检查，但因其有创、昂贵、耗时等缺点，未能普及[3,20]。而以肝功能指标来评价移植物状态存在一定的非特异性和滞后性，因此，探索新的分子靶点作为肝移植术后早期AR的诊断指标具有重要意义[21-23]。

肝移植术后TNC的表达与肝免疫损伤的关系已有很多研究报道[24-25]。如丙型病毒性肝炎患者血清TNC表达水平异常升高，且其升高的程度与肝损伤严重程度呈正相关[26]；当给予高脂高胆固醇饮食时，与野生型小鼠比较，TNC敲除小鼠的肝肿大、肝内炎症细胞浸润及肝纤维化程度均减轻[27]；敲除TNC后可显著减轻小鼠肝损伤程度，抑制白细胞聚集，减少白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、IL-17、CXC趋化因子配体（CXC chemokine ligand，CXCL）2等炎症因子的分泌，并负性调控初始T细胞向辅助性T细胞（helper T cell，Th）17转化，减轻炎症反应程度[28]。此外，在刀豆蛋白A诱导的小鼠急性肝炎模型中，TNC敲除可抑制血清中促炎因子的表达和中性粒细胞、淋巴细胞浸润[29-30]。上述研究提示TNC在肝脏炎症反应过程扮演着重要的角色。本研究团队前期将8例基因敲除小型猪作为供肝来源，对藏酋猴进行辅助性脾窝异位肝移植，对移植肝术前和术后的转录基因差异表达谱进行分析发现，术后TNC显著上调，进一步提示TNC可能在移植物AR中发挥重要作用（研究待发表）。

本研究通过检测大鼠肝移植AR模型中移植肝组织和血清TNC的表达水平，初步证明TNC与大鼠移植肝AR的关系。由于目前缺乏公认的体外研究肝移植机制的细胞模型，因此TNC在AR中的具体作用机制仍未知，有待进一步探索。此外，受限于肝移植术后肝组织标本获取困难，未使用临床肝移植术后标本进行TNC相关检测，可在后续研究中予以补充。

综上所述，TNC在肝移植术后AR中起重要作用，但其具体机制有待进一步研究。探索TNC在肝移植术后免疫损伤中的作用机制，可为临床肝移植术后早期AR的诊断和治疗提供新的靶点。