二甲双胍对H2O2诱导的TM3小鼠睾丸间质细胞氧化应激和细胞凋亡的影响

穆杨，杨菁

(武汉大学人民医院生殖医学中心，武汉 430060)

肥胖不仅会导致糖脂代谢异常、心血管风险增加，还会对生殖系统产生较大的负面影响[1-5]。氧化损伤是肥胖患者发生不育的重要机制之一[6]。最新研究表明，氧化应激可降低男性肥胖患者的雄激素水平，进而损害其生育能力[7]。除较常见的肥胖，造成睾丸氧化应激损伤的因素还包括高龄、精索静脉曲张、不良生活习惯、放化疗等。

二甲双胍是胰岛素增敏剂，临床上常用于治疗Ⅱ型糖尿病，也用于单纯性肥胖的辅助治疗。近期有研究表明，二甲双胍可以抑制靶细胞的氧化应激过度激活，对靶细胞具有保护作用[8-9]。但二甲双胍对氧化应激导致的睾丸间质细胞损伤有怎样的作用及相关作用机制，目前仍未见报道。本研究通过过氧化氢(H2O2)诱导TM3小鼠睾丸间质细胞氧化应激损伤，构建体外细胞模型，观察二甲双胍对TM3小鼠睾丸间质细胞的保护性作用。

材料与方法

一、实验材料

1.细胞来源：TM3小鼠睾丸间质细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

2.主要试剂：DMEM培养基和胎牛血清均购自美国Gibco公司，二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司，CCK8检测试剂盒购自日本同仁生物公司；超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和丙二醛(MDA)检测试剂盒均购自南京建成生物技术有限公司；抗Cleaved-caspase3兔单克隆抗体(9579)和抗GAPDH兔单克隆抗体(5174)购自美国Cell Signaling Technology公司；二甲双胍(HY-B0627)购自美国MedChemExpress公司，其纯度>97.0%。其余实验试剂的纯度均为分析纯。

二、研究方法

1.TM3细胞培养与分组处理：TM3细胞种在6孔板上后，用含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的DMEM培养基在37℃、5%CO2的条件下培养48 h。细胞随机分为4组：正常对照组、二甲双胍组、H2O2模型组及H2O2+二甲双胍组。正常对照组细胞给予PBS处理，二甲双胍组细胞添加终浓度100 μmol/L的二甲双胍，H2O2模型组细胞添加终浓度为200 μmol/L的H2O2，H2O2+二甲双胍组细胞同时添加H2O2(终浓度为200 μmol/L)和二甲双胍(终浓度为100 μmol/L)，干预时间为24 h。二甲双胍溶液的配制方法：用PBS配成1 mmol/L的母液，置于-20℃冰箱内，一周内用完。H2O2使用浓度参考之前文献[10]采用200 μmol/L。

2.睾酮检测：取各组细胞的培养上清液，采用酶联免疫吸附法(ELISA)法检测上清液中睾酮的含量，具体操作按照商业化的试剂盒说明书进行，实验重复6次。

3.细胞存活率检测：TM3细胞种在96孔板上后，细胞密度控制在1×105/孔左右，细胞培养及分组干预处理同上，采用CCK8试剂盒检测TM3细胞存活率，实验重复6次，实验操作步骤按照试剂盒说明书进行。

4.SOD和CAT活性及MDA含量的检测：各组细胞经胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，2 683g离心5 min，收集细胞超声裂解后，4℃，1 200g离心5 min，取上清液，按照试剂盒说明书测定SOD、CAT活性和MDA含量，实验重复6次。

5.实时定量PCR检测睾酮合成酶StAR、P450scc及17β-HSD mRNA表达：收集各组细胞并用PBS清洗3遍后，采用TRIzol裂解液提取细胞总RNA，逆转录获得cDNA。随后采用LightCycler480PCR仪进行扩增，反应条件如下：95℃预变性10 min，然后按照95℃变性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s的顺序循环反应45次。实验引物序列如下：GAPDH：上游5′-AGGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′；下游5′-GCGTGGTCCAGGGTTTCTTACT-3′；StAR：上游5′-TGTCAAGGAGATCAAGGTCCTG-3′；下游5′-CGATAGGACCTGGTTGATGAT-3′；P450scc：上游5′-AGGTGTAGCTCAGGACTTCA-3′；下游5′-AGGAGGCTATAAAGGACACC-3′；17β-HSD：上游5′-ATTTTACCAGAGAAGACATCT-3′；下游5′-GGGGTCAGCACCTGAATAATG-3′。本研究采用GAPDH作为内参对照，实验重复6次。

6.Western blot检测Cleaved-caspase3蛋白的表达：收集各组细胞，加入RIPA细胞裂解液，利用4℃超声裂解后，12 000g离心30 min吸取上清液。随后，采用BCA法测定蛋白浓度。利用10% SDS-PAGE进行蛋白分离，半干法转膜，5%脱脂牛奶封闭30 min，一抗Cleaved-caspase3(1∶500)和GAPDH(1∶1 000)孵育4℃过夜，TBS-T洗膜3次，每次5 min，HRP标记的二抗(1∶10 000)常温孵育2 h，洗膜后采用ECL显色液进行化学发光显色，利用凝胶自动分析成像系统对蛋白条带进行采集和灰度值分析，GAPDH作为内参，计算目标蛋白的相对表达量，进行统计分析。

三、统计学方法

结 果

一、各组TM3细胞的睾酮分泌水平比较

与正常对照组相比，H2O2模型组TM3细胞的睾酮分泌显著降低(P<0.05)；与H2O2模型组相比，H2O2+二甲双胍组细胞分泌的睾酮含量显著升高(P<0.05)；正常对照组与二甲双胍组间的睾酮含量无显著性差异(P>0.05)(图1)。

与正常对照组比较，*P<0.05；与H2O2模型组比较，#P<0.05图1 各组TM3小鼠睾丸间质细胞的睾酮分泌水平比较

二、各组TM3细胞中睾酮合成酶StAR、P450scc和17β-HSD的mRNA表达水平比较

与正常对照组相比，H2O2模型组TM3细胞睾酮合成酶StAR、P450scc和17β-HSD的mRNA表达水平显著降低(P<0.05)；与H2O2模型组相比，H2O2+二甲双胍组细胞睾酮合成酶的mRNA表达水平显著升高(P<0.05)；而正常对照组与二甲双胍组间睾酮合成酶mRNA表达水平无显著性差异(P>0.05)(图2)。

与正常对照组比较，*P<0.05；与H2O2模型组比较，#P<0.05图2 各组TM3小鼠睾丸间质细胞睾酮合成酶StAR、P450scc和17β-HSD的mRNA表达水平

三、各组TM3细胞内SOD、CAT活性和MDA含量的比较

与正常对照组相比，H2O2模型组细胞内SOD和CAT活性显著降低，而MDA水平显著升高(P<0.05)；与H2O2模型组相比，H2O2+二甲双胍组细胞内SOD和CAT活性显著升高，而MDA含量显著降低(P<0.05)；正常对照组与二甲双胍组间细胞内SOD、CAT活性和MDA含量相近，无显著性差异(P>0.05)(图3)。

四、TM3细胞存活率和凋亡相关蛋白Cleaved-caspase3的表达

CCK8实验结果显示，与正常对照组相比，H2O2模型组TM3细胞存活率显著降低[(56.0±9.4)% vs.(100.0±3.4)%](P<0.05)，而H2O2+二甲双胍组细胞存活率显著高于H2O2模型组[(82.3±3.2)% vs(56.0±9.4)%](P<0.05)；正常对照组与二甲双胍组间TM3细胞的存活率比较无显著性差异(P>0.05)(图4A)。Western blot结果显示，与正常对照组相比，H2O2模型组TM3细胞凋亡相关蛋白Cleaved-caspase3表达水平显著上调(P<0.05)；与H2O2模型组相比，H2O2+二甲双胍组TM3细胞内Cleaved-caspase3表达水平显著下调(P<0.05)；正常对照组与二甲双胍组间TM3细胞凋亡相关蛋白Cleaved-caspase3的表达无显著性差异(P>0.05)(图4B)。

与正常对照组比较，*P<0.05；与H2O2模型组比较，#P<0.05图3 各组TM3小鼠睾丸间质细胞内SOD、CAT活性和MDA含量比较

A：各组TM3细胞存活率比较；B：Western blot检测Cleaved-caspase3与GAPDH的蛋白条带图以及各组TM3细胞中Cleaved-caspase3的蛋白相对表达量比较。与正常对照组比较，*P<0.05；与H2O2模型组比较，#P<0.05图4 各组TM3小鼠睾丸间质细胞存活率和Cleaved-caspase3蛋白表达水平比较

讨 论

近年来，肥胖导致的男性不育已引起广泛关注，而雄激素水平下降是肥胖男性不育的主要原因之一[11]。睾丸间质细胞是男性体内合成雄激素最为重要的生殖细胞，肥胖患者睾丸组织中间质细胞功能存在异常。肥胖男性体内伴有氧化应激的过度激活[12]，氧化应激是导致睾丸间质细胞受损的重要原因[13-14]。基于此，我们利用H2O2刺激小鼠睾丸间质细胞来模拟睾丸局部氧化应激微环境。通过研究发现，H2O2处理后TM3小鼠睾丸间质细胞的存活率和功能明显异常，提示肥胖患者睾丸局部氧化应激微环境确实是睾丸间质细胞功能异常的原因之一。

二甲双胍是临床上用于治疗糖尿病的常见双胍类口服降糖药，能显著提高胰岛素敏感性。研究发现二甲双胍可显著降低肥胖患者的体重及全身脂肪重量，此外，二甲双胍对肥胖患者的脂质代谢也有明显的改善作用，可显著降低肥胖患者的血清总胆固醇、甘油三酯水平[15]。还有研究报道二甲双胍可减轻肥胖导致的睾丸血睾屏障受损[16]。我们的前期研究也发现二甲双胍可改善肥胖导致的脂质代谢及性激素紊乱，减轻睾丸局部的炎症反应进而提高肥胖大鼠睾丸的生精功能[17]。有研究表明，二甲双胍可以抑制氧化应激的过度激活[18]。多囊卵巢综合征(PCOS)伴肥胖、体重超重的患者，多伴有高胰岛素血症、胰岛素抵抗，二甲双胍通过提高其胰岛素敏感性具有辅助治疗作用。二甲双胍可通过调节糖酵解途径改善PCOS患者的排卵障碍[19]。此外，二甲双胍还可以通过抑制氧化应激调节PCOS患者的激素水平[20]。本研究结果表明，二甲双胍可显著改善H2O2导致的睾丸间质细胞功能受损，主要表现为细胞存活率的升高，睾酮含量增加，睾酮合成酶的表达上调。此外，本研究还表明，二甲双胍可显著抑制氧化应激和细胞凋亡，表现为SOD和CAT活性的增加，MDA含量的降低，凋亡相关蛋白Cleaved-caspase3表达降低。

本研究还存在一定局限性。首先，我们并没有在动物水平验证二甲双胍改善睾丸间质细胞功能的作用；其次，未对二甲双胍改善睾丸间质细胞功能的具体机制进行探讨，这些问题值得后续进一步探索。

综上，本研究揭示了二甲双胍对H2O2介导的睾丸间质细胞损伤具有重要的保护作用，深化了间质细胞功能障碍在男性不育中的认识，为间质细胞功能障碍导致的男性不育的临床治疗提供了新的思路。