少弱精子症与亚甲基四氢叶酸还原酶C677T 基因多态性分布及频率的相关性分析

张永乐 施新萍 任黎刚 陈建和 张联珍 陈丽萍

浙江省立同德医院基因检测中心（浙江杭州 310012）

不孕不育症已成为严重影响人类健康的世界第三大疾病，据WHO 统计，不孕不育发生率占育龄夫妇的12%～15%，全球有超过8000 万患者，而男女发病各占50%左右[1-2]。 精子密度的改变在男性不孕不育发生率中占相当比率，约45%患者有少精子症，20%患有无精子症[3]。 一项连续五年的研究发现，健康成年男性精子密度平均值呈逐年下降趋势[4]。而诱发这一因素主要原因与空气污染、吸烟、压力、化学毒物等相关[5-6]。近年来人们研究发现，饮食中的一些元素改变也在影响精子的功能，导致男性不孕不育的发生，从动物实验，体外细胞培养研究结果表明， 一些营养元素在调节精子的生成、成熟和受精等方面起着重要的作用，而这些营养成份中叶酸缺乏显得尤为突出[7]。 亚甲基四氢叶酸还原酶（Methylenetetrahydrofolate reductase ；MTHFR） 是一种重要的调控酶，参与叶酸代谢，而MTHFR C677T 基因的多态性直接与叶酸代谢相关[8]。 本研究以正常生育能力的男性为对照，观察少弱精子症患者MTHFRC677T 基因的多态性，分析基因分型分布及基因频率与少弱精子症的关系。

材料与方法

一、研究对象

收集2016 年3 月～2019 年12 月期间， 在浙江省立同德医院不孕不育门诊和男科门诊就诊的少弱精子症患者128 例为研究对象视为观察组， 平均年龄为32岁（23 ～38）。选择同期正常精子质量的男性108 例视为对照组，年龄在25～40 岁，

二、观察组纳入标准[9]

至少两次精液常规分析确定为少弱精子症患者（诊断参照WHO 第五版），排除标准：①染色体核型异常；②Y 染色体微缺失；③精索静脉曲张；④隐睾；⑤生殖泌尿系统病原体感染或手术； ⑥重金属或其他环境污染物暴露者；⑦长时间高温环境工作者。 平均年龄为32 岁（23～38）。 对照组纳入标准：男方本次精液常规分析均在正常范围内。

三、研究方法

取受试者静脉全血2ml 置于EDTA 抗凝管中，送往本院PCR 室， 采用多重实时荧光PCR 技术进行C677T 基因多态性分析， 试剂盒为武汉友之友生物科技股份有限公司提供。 DNA 提取，裂解：取200μl 调整好的细胞溶液置于1.5ml 的无菌离心管中， 加入20μl蛋白酶K 和200ul 细胞裂解液（cell lysis solution），充分混匀后，56℃水浴10min。核酸沉淀：向裂解后的离心管中加入无水乙醇200μl 充分混匀后全部转入带滤膜的柱中放入离心半径为10cm 离心机中以11180g 转速离心2min,弃废液。 洗涤：向柱中加入预配好的DW1 洗液600ul,再次11180g 转速离心2min,弃废液，再向柱中加入预配好的DW2 洗液600ul，11180g 转速离心，2min;弃废液，重复DW2 洗涤一次；将柱转入洁净离心管中11180g 转速离心5min,弃离心管；更换另一洁净离心管将柱置入，开盖室温放置5min,使残余酒精充分挥发。 核酸洗脱：将柱植入无菌的1.5ml 离心管中，加入50μlGE洗脱液（注意洗脱液加入膜的中间，但禁止移液枪头接触膜），室温放置5min，11180g 转速离心2min，收集总DNA 模板备用， 洗脱后的总DNA 使用紫外分光光度仪进行浓度和纯度的测量， 保证浓度和纯度达到PCR检 测 要 求， ( 总 DNA 浓 度 ＞20ng/μl； 纯 度1.5＜A260/A280＜2.0)，DNA 模板立即进行PCR 或-70°冷冻保存， 提取试剂盒为北京天根生物科技有限公司提供。 PCR 扩增:扩增总体系20μl（反应液18μl，模板2μl）， 扩增条件为，37℃2min，95℃5min，95℃15S 58℃45S 运行40 个循环，结束扩增，仪器自动分析，根据不同的荧光报告曲线判定结果。

四、观察指标

观察两组受检者MTHFR C677T 基因多态性，具体包含纯合野生型(CC)，杂合突变型（CT），纯合突变型（TT）以及C,T 等位基因的出现频率。

五、统计学分析

采用Hardy-Weinberg 遗传平衡定律检验对研究资料的可靠性分析，应用SPSS 20.0 软件对本研究资料进行统计处理，计量资料以（±s）表示，采用t 检验，计数资料以“%”表示，采用χ2检验，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

结 果

一、观察组和对照组年龄差异性分析

128 例观察组年龄分布为23～38 岁，平均年龄为32 岁，108 例对照组年龄分布为25～40 岁，平均年龄为33.5 岁，两组年龄比较t=0.876，P＞0.05,差异不具有统计学意义。

二、 研究资料基因多态性采用Hardy-Weinberg 遗传平衡定律分析选择资料的可靠性

观察组和对照组的所有基因型进行Hardy-Weinberg 遗传平衡定律分析， 结果显示χ2分别为0.092 和0.027，P＞0.05, 因此所选人群基因型频率符合遗传平衡法则，具有恒定性，数据统计见表1。

表1 对照组和观察组Hardy-Weinberg 遗传平衡定律分析结果

三、观察组和对照组MTHFR C677T 基因型表达

观察组中MTHFR C677T 基因表达为CC 型基因的人比率显著低于对照组，而表达TT 型基因的比率显著高于对照组， 两组比较存在统计学差异P＜0.05，CT型基因表达两组比率相当，无统计学差异P＞0.05.统计数据见表2。

表2 观察组与对照组MTHFRC677T 基因型表达比率（%）

四、观察组和对照组MTHFRC677T 基因中C，T 等位基因表达

观察组中MTHFR C677T 基因中C，T 等位基因分别为38.67%，61.33%；对照组中MTHFR C677T 基因中C，T 等位基因分别为55.09%，44.91%，C，T 等位基因表达两组存在统计学差异P＜0.05，数据统计见表3。

表3 观察组与对照组MTHFR C677T 基因中C，T 等位基因表达频率比较（%）

讨 论

男性不育是复杂疾病。 近来研究表明，叶酸对于男性生殖健康起到至关重要作用[9]，Lambrot 等[10]人研究提示给雄性小鼠长期使用缺少叶酸的饲料可导致小鼠睾丸精母细胞减数分裂启动延迟，Swayne 和Ly[11-12]分别报道了叶酸缺乏可致小鼠睾丸精子生成减少。 Najafipour 等[13]调查研究健康男性低叶酸摄入人群呈现精子密度显著降低。 敲除叶酸代谢相关基因的动物模型实验进一步证实了叶酸是保障精子正常生成的必须物质[14]。 叶酸是一种重要的水溶性B 族维生素，它的吸收、代谢常受多种酶调控，比如：亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)，甲硫氨酸合成酶(MTR) 和甲硫氨酸合成酶还原酶 (MTRR) 是叶酸代谢途径中的关键限速酶，而MTHFR C677T 和A1298C，MTR A2756G 及MTRR A66G 等单核苷酸多态性(SNP)的存在常影响这些酶的活性。 研究报道[15]MTHFR C677T 纯合突变型TT 基因可使酶活性下降一半以上，临床研究资料[16]指出MTHFR C677T 位点多态性与特发性男性不育的精液参数异常密切相关，进而推测叶酸代谢途径异常，引起叶酸利用率下降，阻碍了精子的生成、发育过程，从而导致不育的发生。

本研究对少弱精子患者的观察组与健康男性患者的对照组进行MTHFR 基因C677T 位点多态性检测分析，结果表明，观察组的TT 基因型和T 等位基因分布频率显著高于观察组， 差异有统计学意义P＜0.05。 TT基因型的百分比和T 等位基因分布频率与我省蔡丽伟的报道一致[17]。 其实早在2001 年德国学者Bezold 等[18]已报道不育男性TT 型基因比率显著高于正常对照人群，提示MTHFR C677T 基因突变是导致男性不育的一因素。 此后研究印度、韩国、意大利等国男性也发现这一结论[19-20]。 但也有不同的结论Ravel 等[21]报道法国男性不育患者与MTHFR C677T 基因多态性无明显关联。提示MTHFR C677T 基因多态性在不同种族、地域内表现也不相同，另一方面，不同地域的饮食习惯日摄入叶酸的含量不同也可对检测结果造成一定的干扰， 饮食中大量摄入叶酸即便MTHFR C677T 基因表现为TT型， 但体内叶酸供应充足也不会出现因少弱精子而引起不育症[15]。

近年来研究发现高同型半胱氨酸（Hcy）血症与多种疾病相关，邵丽佳等和戈一峰等[22-23]人的研究报告显示高Hcy 与男性不育相关, 他们认为高Hcy 可抑制谷胱甘肽合成，谷胱甘肽为活性氧的清除物质，当谷胱甘肽减少时， 精液中活性氧产生与清除的动态平衡被破坏，造成精子生成减少、精子DNA 损伤等，最终导致精液质量降低； 此外高Hcy 血症可能引起睾丸中血管过早发生动脉硬化，影响睾丸的血液供应，导致生精功能障碍。 而高Hcy 血症的产生又与MTHFR C677T 基因多态性相关，TT 型基因人群更易患高Hcy 血症。

综上所述， 无论是因为保障精子正常生成的必须物质- 叶酸缺乏， 还是高Hcy 血症引起的活性氧产生与清除的动态平衡被破坏或者睾丸血管过早发生动脉硬化，MTHFR C677T 基因多态性在其中扮演着重要角色。 因此对少弱精子症患者早期进行MTHFR C677T基因多态性检测， 评估患者是否因叶酸缺乏导致精子数量、质量下降都具有重要意义，为合理补充叶酸提供临床依据。