不同分化程度胃癌患者血清ANXA7、E-cadherin水平变化及联合监测临床意义探讨

吕松林，王喆，李坤朋

（河南省南阳市第二人民医院检验科，河南 南阳 473000）

2015 年中国癌症数据报告显示, 我国每年胃癌新发与死亡病例分别为67.9 万、49.8 万例，而从全球范围讲,近一半新发胃癌患者和死亡病例在我国，成为危害中国居民健康主要疾病之一[1,2]。尽管现阶段诊疗技术有很大进步,但早期胃癌缺乏特异性表现，检出率仍较低，确诊时大多患者已进入中晚期，预后效果较差，因此研究胃癌相关内容意义重大。目前放化疗是治疗中晚期胃癌重要手段，但有效率偏低，基本原因在于癌细胞凋亡率较低，且不能有效控制细胞增殖[3,4]。膜联蛋白A7（Annexin A7，ANXA7）系膜联蛋白A 家族一员，具有多种生理功能，可参与细胞膜离子通道调控、细胞骨架结构活动、细胞信号调控、细胞膜受体构象、细胞胞饮和胞吐及细胞分裂、增殖、分化、凋亡等[5,6]。E 钙蛋白（E-cadherin）是一种钙离子依赖性细胞黏附蛋白，对细胞间信号转导、细胞形态维持、紧密连接等至关重要[7]。研究发现，不同种类恶性肿瘤中，ANXA7、E-cadherin 表达存在异常，可能与恶性肿瘤有关[8,9]。目前胃癌患者及不同分化程度胃癌AN XA7、E-cadherin 表达尚不明确, 是否与癌细胞增殖、凋亡有关及是否拥有潜在价值仍有待探讨。鉴于此本研究选取200 例胃癌患者，探讨不同分化程度胃癌患者血清ANXA7、E-cadherin 水平变化及联合监测临床意义，报告如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选取 2018 年 2 月-2019 年 3 月我院收治的200 例胃癌患者作为胃癌组，选取同期非胃癌健康体检者200 例（对照组）及良性胃部疾病200 例（良性胃病组），各组性别、年龄等资料均衡可比（P＞0.05）。

1.2 纳入标准及排除标准 ⑴纳入标准：胃癌组均根据《胃癌病理分型和诊断标准的建议》[10]诊断；自愿签署知情同意书； 未合并全身其他已知恶性肿瘤；无晕血症。⑵排除标准：听力、语言交流存在障碍者；认知、精神异常者；合并脓毒症等急性感染类疾病者；再生障碍性贫血者。

1.3 方法

1.3.1 主要试剂、仪器 ANXA7 试剂盒（上海科研试剂厂）；E-cadherin 试剂盒（上海纪宁酶联科技有限公司）；loading Buffer（杭州弗德生物科技有限公司）；ANXA7 一抗、 二抗 （艾美捷科技有限公司）；E-cadherin 一抗、二抗（上海瑞齐生物科技）；Proteinase K 工作液 （上海起发实验试剂有限公司）；流式细胞仪（美国BD 公司）；酶标仪（美国伯腾仪器有限公司BioTek）。

表1 各组一般资料比较

1.3.2 血清ANXA7、E-cadherin 检测 肘部常规消毒后采集静脉血，以酶联免疫吸附法检测血清ANXA7、E-cadherin 水平。

1.3.3 western blot 检测胃癌组织 ANXA7、E-cadherin 匀浆器制作胃癌组织匀浆，收集悬液，离心，取上清，BCA 法测蛋白浓度，加入 loading Buffer，电泳，转模，封闭，加入 ANXA7、E-cadherin 一抗、二抗，洗膜，ECL 显影，Quantity One-4.6.2 软件定量分析，以目的条带与β-action 比值作为ANXA7、E-cadherin 蛋白表达水平。

1.3.4 TUNEL 法检测胃癌细胞凋亡 不同分化程度胃癌组织，用Proteinase K 工作液、透化液处理，PBS 漂洗5min×2 次，设置阴性对照和阳性对照，滴加 TUNEL 反应液 50μl,保湿避光,孵育(60min、37℃),PBS 漂洗 5min×3 次，滴加 PI 染液 5min，重复PBS 漂洗3 次，每张切片观察5 个视野，每个视野计数100 个细胞中的凋亡细胞数，取其平均值为凋亡指数,根据（凋亡细胞数/计数细胞总数）×100%进行计算。

1.4 观察指标 ⑴比较各组血清ANXA7、E-cadherin 水平。⑵绘制胃癌患者 ANXA7、E-cadherin接收者操作特征曲线 （ROC），分析 ANXA7、E-cadherin、ANXA7+E-cadherin 诊断价值。⑶比较不同分化程度胃癌患者血清及胃癌组织ANXA7、E-cadherin 水平。⑷采用 Spearman 分析 ANXA7、E-cadherin 与分化相关性。

1.5 统计学方法 采用SPSS22.0 统计学软件处理数据，计量资料以（±s）表示，多组间比较以单因素方差进行分析，两两比较以LSD-t 检验，计数资料用 n（%）表示、χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清 ANXA7、E-cadherin 胃癌组血清ANXA7、E-cadherin 均较对照组、 良性胃病组高（P＜0.05）； 对照组与良性胃病组血清 ANXA7、E-cadherin 比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表2 各组血清 ANXA7、E-cadherin比较（±s）

表2 各组血清 ANXA7、E-cadherin比较（±s）

组别胃癌组对照组良性胃病组例数 ANXA7（ng/L）200 200 F P 76.25±8.54 60.21±5.19 61.03±3.97 423.427 0.000 E-cadherin（ng/ml）33.71±5.98 24.66±6.91 23.95±7.28 130.150 0.000

2.2 ROC 曲线 以胃癌组为阳性样本，以对照组和良性胃病组为阴性样本进行ROC 分析，结果显示，ANXA7 ROC 曲线下面积为 0.861,以 70.09 ng/L 作为临界值，对胃癌诊断敏感性为65.00%，特异性为95.00%，E-cadherin ROC 曲线下面积为 0.749，以29.87ng/ml 作为临界值,对胃癌诊断敏感性为84.00%，特异性为65.00%。见图1。

图1 ROC曲线

2.3 不同分化程度血清ANXA7、E-cadherin 不同分化程度胃癌患者血清及胃癌组织ANXA7、E-cadherin 比较差异具有统计学意义，高、中、低分化血清及胃癌组织ANXA7、E-cadherin 依次升高（P＜0.05）。见表4。

表3 ROC分析结果

表4 不同分化程度胃癌患者ANXA7、E-cadherin比较（±s）

表4 不同分化程度胃癌患者ANXA7、E-cadherin比较（±s）

血清ANXA7（ng/L）胃癌组织分化程度 例数E-cadherin（ng/ml）ANXA7 E-cadherin高分化中分化低分化105 64 31 F P 69.22±6.05 78.77±10.63 94.88±12.64 102.488 0.000 28.88±5.89 37.16±6.08 44.79±6.11 97.717 0.000 0.81±0.25 1.20±0.24 1.55±0.26 123.465 0.000 0.73±0.18 1.06±0.23 1.39±0.25 132.851 0.000

2.4 ANXA7、E-cadherin 与分化、 凋亡相关性分析ANXA7、E-cadherin 与胃癌分化程度、凋亡指数均呈负相关（P＜0.05）。见表5。

表5 ANXA7、E-cadherin与分化相关性分析

3 讨论

近年来研究发现，胃癌患者中很多异常基因、蛋白、 细胞因子等通过各种途径促进肿瘤细胞侵袭、生长、转移，与胃癌发生发展密切相关，因此研究这些基因、蛋白、细胞因子，将其应用于临床，可能有助于评估胃癌预后,并可能为胃癌治疗提供生物学治疗靶点，提高癌细胞杀伤率，最大程度扩大患者受益[11]。

膜联蛋白家族在动植物中均广泛分布，包含5个家族（A、B、C、D、E），均拥有磷酸化位点、蛋白调节区域即独特功能N 端结构域、钙结合位点，而N端结构域长度和序列不同是家族成员间主要差异,决定了不同生物学活性和功能，其中ANXA7 定位于人体染色体10q21，有促进细胞分泌、调节细胞生长和周期、参与信号传导等多方面功能[12]。动物学实验表明,上调ANXA7 可促进肝癌细胞迁移[13]。Huang Y 等[14]发现，无论是通过 RNA 干扰（RNAi）技术在基因水平下调ANXA7 还是在蛋白质水平上使用针对ANXA7 抗体, 抑制ANXA7 表达均可诱导凋亡并降低肝癌细胞侵袭和迁移能力。Yuan HF 等[15]研究指出，ANXA7 在胃癌中阳性表达率为65.3%，且阳性患者生存率明显低于阴性患者。可见ANXA7 与恶性肿瘤生物学行为有关，可能是影响患者预后因素。本研究对此进行探讨发现，胃癌组血清ANXA7、E-cadherin 均较对照组、良性胃病组高（P＜0.05），而对照组与良性胃病组血清ANXA7、E-cadherin 比较，差异无统计学意义（P＞0.05），表明ANXA7 与胃癌有关。且高、中、低分化血清及胃癌组织 ANXA7 依次升高（P＜0.05），提示 ANXA7可能与胃癌分化程度有关。进一步进行Spearman分析发现，ANXA7 与胃癌分化程度呈负相关 （P＜0.05），直接佐证了以上结果，说明高表达ANXA7是胃癌低分化独立危险因素。

E-cadherin 主要存在于细胞外基质或细胞表面中[16]。Stewart CJ 等[17]研究通过观察 12 例宫颈癌患者发现，50%宫颈癌患者在疾病早期E-cadherin即呈阳性表达。Liu M 等[18]研究指出，E-cadherin 阳性表达可视为上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）标志物，而 EMT 赋予了细胞转移和入侵能力。亦有研究指出，未分化/去分化子宫内膜癌E-cadherin 明显高于高级子宫内膜样腺癌和透明细胞腺癌[19]。可见E-cadherin 与恶性肿瘤微环境变化、分化程度有关。本研究发现,胃癌组血清E-cadherin 均较对照组高 （P＜0.05）, 提示 E-cadherin 与胃癌有关。且高、中、低分化血清及胃癌组织 E-cadherin 依次升高（P＜0.05），说明 E-cadherin可能与胃癌分化程度凋亡有关。进一步进行Spearman 分析发现，E-cadherin 与胃癌分化程度呈负相关（P＜0.05），验证了以上结果，表明E-cadherin 高表达亦是胃癌低分化独立危险因素。

分化程度可反映肿瘤细胞恶性程度。通常对临床分期相同恶性肿瘤患者，分化程度越高，预后越好[20]。从治疗角度讲，分化程度可指导临床选取对应治疗手段,因此肿瘤细胞分化程度是癌症诊断和治疗中一个重要参考数据。根据以往研究，肿瘤细胞分化程度与细胞凋亡、增殖具有相关性[21]。而本研究结果证实，ANXA7、E-cadherin 均与胃癌分化程度有关，可为临床评估胃癌分化程度、预后判断、治疗方法选取提供参考。此外本研究还发现，ANXA7 ROC 曲线下面积为0.847,以＞67.63 ng/L 作为临界值，对胃癌诊断敏感性为75.50%，特异性为81.00%，E-cadherin ROC 曲线下面积为 0.827，以＞30.05 ng/ml 作为临界值，对胃癌诊断敏感性为68.00%,特异性为87.00%；ANXA7+E-cadherin ROC 曲线下面积为0.921，以两者均阳性为阳性标准,对胃癌诊断敏感性为81.00%,特异性为88.00 %。提示ANXA7、E-cadherin 用于胃癌诊断亦具有较高参考价值，且ANXA7 联合E-cadherin 诊断特异度较高。

综上所述，胃癌患者血清ANXA7、E-cadherin高表达，可用于胃癌诊断，且与胃癌分化程度均呈负相关。