宫颈液内炎症因子及菌群水平与产妇早产相关性研究

卢涛，牛玉玲

（开封市妇幼保健院妇科，河南 开封 475000）

早产是一种全球性流行病。近年来发现，早产可导致每年超过一百万婴儿的死亡[1]，也是五岁以下儿童死亡的主要原因[2]。早产有多种病因，但在多达50%的早产病例中，感染被认为是一种潜在的致病机制[3]。其中，生殖道感染引起的炎症可能是导致早产的重要原因[2]。孕期阴道菌群紊乱与早产也有一定的相关性[3,4]。宫颈液内炎症因子及菌群水平与妇女早产是否有一定的关系，目前研究尚不充足。本研究主要探究宫颈液内炎症因子及菌群水平与妇女早产的相关性，为预防孕妇早产提供理论依据。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象 选取 2017 年 10 月-2019 年 10 月我院收治的年龄20～40 岁早产孕妇（孕周＜37 周+0天）和足月孕妇各50 例。孕妇需满足：⑴单胎妊娠，自然受孕；⑵采集样本前3 天内无性生活；⑶无其他合并症，如心脏病，糖尿病，前置胎盘等；⑷无子宫或胎儿异常；⑸无活动性阴道感染；⑹过去2 周内未使用抗生素治疗或抗炎治疗；⑺取得孕妇及其家属知情同意。

1.3 样本采集 孕妇分娩42d 后，通过无菌窥阴器暴露宫颈，用无菌宫颈拭子采集宫颈分泌物。收集宫颈拭子，用10 ml 无菌盐水注入宫颈后穹窿进行灌洗，收集灌洗液进行宫颈炎性标记物分析。宫颈拭子储存于-80℃，用于后续微生物检测。宫颈灌洗液离心取上清液保存在-80℃，用于炎症因子的检测。

1.4 宫颈液微生物组分析 宫颈微生物组分析由南京金唯智生物科技公司完成。使用蛋白珠法从宫颈拭子中提取总基因组DNA，以 20-30ng DNA为模板，使用金唯智设计的一系列 PCR 引物扩增原核生物 16S rDNA 上包括 V3 及 V4 的 2 个高度可变区。另外，通过 PCR 向16S rDNA 的 PCR产物末端加上带有 Index 的接头，以便进行NGS测 序 。通 过 Qubit3.0 Fluorometer (Invitrogen,Carlsbad, CA)检测文库浓度。双端测序得到的正反向reads 首先进行两两组装连接，过滤拼接结果中含有N 的序列，保留序列长度大于200bp 的序列。经过质量过滤，去除嵌合体序列，最终得到的序列用于 OTU 分析，使用 VSEARCH（1.9.6）进行序列聚类（序列相似性设为 97%），比对的16S rRNA 参考数据库是 Silva 132。然后用 RDP classifier (Ribosomal Database Program) 贝叶斯算法对 OTU 的代表性序列进行物种分类学分析，并在不同物种分类水平下统计每个样本的群落组成。

1.5 宫颈灌洗液炎症因子分析 采用Luminex 多重分析检测宫颈灌洗中炎症因子的浓度。使用10 种分析物多重测定板 （Milliplex MAP 人细胞因子/趋化因子磁珠多重测定板，HCYTOMAG-60K-10，上海益启生物科技有限公司），按照制造商建议的方案一式两份地测定灌洗液中的细胞因子和趋化因子浓度，并使用Bio-Plex 读取数据。使用Bio-Plex Manager 软件（Bio-Rad）分析数据。

1.6 统计学分析 对采集的数据使用SPSS 19.0 进行数据分析，连续变量采用均数±标准误（mean ±SD）表示，分类变量采用中位数和四分位数表示。两组之间比较采用t 检验，宫颈液内炎症因子及菌群水平与妇女早产之间的关系采用Spearman 秩相关检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 早产组和足月组孕妇一般情况的比较 早产组和足月组孕妇年龄，体重指数（BMI），早产史,怀孕次数,产检次数差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 早产组和足月组孕妇的一般情况

2.2 早产组和足月组孕妇宫颈液中菌群相对表达量的比较 研究表明，Chao1 指数和Shannon 指数是评价菌群多样性的指标[5]，Chao1 指数是一种未加权测量微生物多样性的方法，反应不同微生物数量。Shannon 指数是一种加权测量微生物多样性的方法，反应微生物的数量和比例。与足月组相比，早产组Chao1 指数和Shannon 指数明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），表明早产与宫颈中菌群紊乱具有明显的相关性。见表2。

表2 早产组和足月组孕妇宫颈液中菌群多样性的比较

2.3 早产组和足月组孕妇宫颈-阴道灌洗液中炎症因子水平的比较 早产组宫颈灌洗液中IL1-β、IL-6、 和 IL-8 较足月组孕妇明显升高 （P＜0.001），而TNF-α 和 MCP-1 差异无统计学意义（P＞0.05）。表明早产与宫颈液中炎症因子的增加具有相关性。见表3。

表3 早产组和足月组孕妇宫颈- 阴道灌洗液中炎症因子水平

2.4 早孕组宫颈液炎症因子与宫颈-阴道液中菌群多样性的比较关系 早产组炎症因子IL1-β 与Chao1 指数的相关系数 r=0.718，P＜0.001，IL-8 与Chao1 指 数 的 相 关 系 数 r=0.7180.474，P=0.019，IL1-β 与 Shannon 指数的相关系 数 r=0.623，P=0.032，IL-8 与 Shannon 指数 r=0.554，P=0.045，具有正相关性，表明宫颈灌洗液炎症因子IL1-β 和IL-8 与宫颈液中菌群紊乱有关。而 IL-6、TNF-α和 MCP-1 与 Chao1 指数和 Shannon 指数无相关性（P＞0.05）。见表4，表5。

表4 早产组孕妇Chao1 指数和炎症因子的关系

表5 早产组孕妇Shannon指数和炎症因子的关系

3 讨论

孕妇早产是导致围产期新生儿死亡和疾病的重要原因。正常女性怀孕期间，子宫颈是机体抵抗细菌和病原菌的功能屏障和物理屏障,可保护子宫和胎儿免受来自于阴道上行性感染[6]。宫颈液成分的改变可能对早产、HPV 感染以及宫颈癌变等疾病有一定的预测作用[7,8]。健康女性生殖道的菌群相对简单，主要是乳酸杆菌属，乳酸杆菌比例下降可导致生殖道微生态失衡。研究发现，阴道厌氧菌的增多与不良妊娠反应有关[9]。细菌性阴道炎、真菌性阴道炎和宫颈上皮内瘤变的女性,阴道菌群改变[4,10,11]，且早产和晚期流产的风险也是正常女性的2倍和6 倍[4]。本研究发现，与足月产孕妇相比，早产孕妇宫颈液中菌群的多样性明显改变,表明宫颈液中微生物的多样性与早产具有明显的相关性。

研究表明，宫颈液中菌群的改变可增加宫颈IL-4、IL-6 和 TGF-β1 等炎症因子的表达[12,13]。而宫颈炎症的增加与不良妊娠的发生有关[14,15]。宫颈液中IL-6 的增加与胎膜早破有关[16]。本研究发现与足月组孕妇相比，早产组孕妇宫颈液中IL1-β、IL-6、和IL-8 的表达明显升高，表明宫颈液中炎症因子 IL1-β、IL-6、 和 IL-8 与早产具有明显的相关性，进一步比较宫颈液中炎症因子和菌群多样性发现IL1-β 和IL-8 表达与宫颈液菌群Chao1 指数和Shannon 指数具有一定的相关性。

综上所述,宫颈液内炎症因子及菌群水平与孕妇早产存在相关性,通过干预宫颈液炎症因子或者菌群可能为防止孕妇早产提供一定的手段。