内皮微颗粒对新生儿ABO溶血病预后价值的研究

杨旭，杨讯，许词，胡松，余东，韩海心

（南阳市中心医院输血科，河南 南阳 473000）

母胎血型不合介导的免疫反应是导致新生儿溶血病 （hemolytic disease of the newborn，HDN）的重要原因[1]。胎儿红细胞（red blood cells，RBC）可被来自父系的抗RBC 同种抗体破坏[2]。我国新生儿溶血症病例多数属于ABO 溶血（ABO-HDN），但目前尚缺乏有效的方法对ABO-HDN 进行预测。近年来Awad 等人的一项研究显示,CD144+内皮微颗粒（Endothelial microparticles，EMP）是 ABO-HDN内皮损伤的标志物之一[3]。微粒是一类在某些生理或病理状况下, 由正常细胞出芽并脱落的颗粒,外周血中微粒多来源于血细胞或血管内皮细胞,在细胞间信号通路传递和促进凝血等方面起到重要作用[4,5]。微粒直径多在 0.2-2.0μm 之间，表面含有多种抗原成分[6,7]。在这些微粒中EMP 被认为可作为血管损伤的生物标志物之一, 并且具有无创的优点,是目前研究的热点之一[8]。现如今已有多种抗原可用于 EMP 的检测，如 CD31、CD31、CD34、CD51、CD54、CD62E、CD105、CD106、CD144 和 CD146 等[9]，其中由于CD144（又称VE-钙粘蛋白）目前尚未发现在任何血细胞中表达，因此是EMP 检测中特异性最高的标志物之一[10]。但目前关于EMP 对ABO-HDN 的产与ABO 血型不合之间相关性尚缺乏深入研究，因此本研究旨在探索EMP 对ABOHDN 的预测价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象 本研究回顾性纳入了2017 年6月-2019 年 6 月之间就诊于我院的 55 例 ABOHDN 新生儿、50 例 Rh-HDN 新生儿和 50 例母婴血型匹配的健康新生儿作为对照组。排除标准为：⑴合并活动性感染；⑵未能完成EMP 检测。

1.2 标本留取预先处理 所有入组新生儿均留取外周血标本并经EDTA 抗凝处理，外周血用于常规血液学检查和直接Coombs 试验。对于流式细胞学检测标本，采用1.8ml 外周血和0.2ml 柠檬酸钠（3.8%）混合。对于血清标本，将外周血置于体外凝结 1h，然后采用 80×g 条件下离心 15min，血清用于间接抗球蛋白试验、生化分析和C 反映蛋白（C-reactive protein，CRP）检测。

1.3 诊断相关检测和流式细胞学检测 血常规采用Sysmex XT―1800i 全自动血细胞分析仪完成，红细胞形态和白细胞各种亚型计数采用利什曼染色外周血涂片方法，网织红细胞采用亮甲酚蓝(brilliantcresylblue,BCB)染色方法完成。新生儿及母亲的抗体检测采用直接和间接Coombs 试验。其他实验室检测结果，如肝肾功能、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）和间接胆红素（indirect bilirubin）等溶血标志物、 高敏C 反应蛋白采用罗氏Cobas Integra 800 全自动生化分析仪完成。血管性血友病因子抗原（vWF-Ag）的定量分析采用Sysmex CA_1500 全自动凝血分析仪完成。

EMP 检测采用抗CD144 抗体流式细胞学检测完成[11]，将柠檬酸钠处理后的外周血按照1:50 于磷酸盐缓冲液中进行稀释，将50μL 稀释血液和5μL 藻红蛋白标记的抗CD144 抗体混合，室温下暗室孵育20 分钟后采用EPICS-XL PROFILE II Coulter 流式分析仪（美国Coulter 公司）完成检测。同型对照IgG 抗体购自Coulter 公司。EMP 的流式检测结果如图1 所示：说明抗CD144 抗体中EMP阳性比例超过90%；侧面印证，EMP 足以用于在抗CD144 抗体分析其与ABO-HDN 的关系。

1.4 统计学方法 数据分析采用SPSS 15.0 软件完成。连续性变量均符合正态分布，采用平均值±标准差表示，分类变量采用频数表示。连续性变量组间差异采用单因素方差分析和Tukey’s test 多种比较，分类变量采用Pearson 卡方检验或Fisher 精确检验比较组间差异。采用Spearman 检验行相关性分析。本研究以双侧检验P＜0.05 为差异具有统计学意义。著统计学差异。ABO-HDN 组直接Coombs 试验和间接Coombs 试验阳性病例数分别为8 例和11例。三组人群白细胞计数和血小板计数方面无显著统计学差异，但ABO-HDN 和Rh-HDN 新生儿血红蛋白显著低于健康对照组、 网织红细胞显著高于对照组，同时ABO-HDN 和Rh-HDN 新生儿血胆红素和LDH 水平也显著高于健康对照组。ABO-HDN 和Rh-HDN 新生儿治疗前EMPs 和血管性血友病因子抗原(vWF Ag)显著高于健康对照组，但ABO-HDN 和Rh-HDN 新生儿两组之间无显著统计学差异，并且ABO-HDN 和Rh-HDN 新生儿治疗后EMPs 之间无显著统计学差异。

2.2 治疗前EMP 与血红蛋白相关性分析 我们进一步采用相关性分析探索治疗前EMP 与血红蛋白相关性，结果如图2 所示，二者之间存在显著负性线性相关性（r=-0.823，P＜0.05）。

图2 治疗前EMP与血红蛋白相关性分析

图1 EMP流式细胞学检测

2 结果

2.1 患者一般资料 本研究共纳入55 名ABOHDN 新生儿、50 名 Rh-HDN 新生儿和 50 名健康对照组新生儿。结果如表1 所示，三组新生儿在胎龄、 性别和出生体重方面均无显著统计学差异，ABO-HDN 和Rh-HDN 组在治疗方法方法上无显

2.3 回归分析结果 多因素回归分析结果如表2所示，ABO-HDN 组的血红蛋白、LDH 和间接胆红素水平与治疗前EMP 水平独立相关。Rh-HDN 组中只有血红蛋白和LDH 水平与治疗前的EMP 水平独立相关。

3 讨论

光滑的血管内皮对于保护血管结构的重要性不言而喻。当其受损时,内皮细胞便释放细胞因子从而改变血管功能，继而引发各类心血管事件。因为早期内皮功能异常是可以通过干预逆转的,所以找到能特异性反映心血管功能异常的生物性标志物是研究各类血管和血液性疾病的重要探讨方向，EMP 探索即据此应运而生。EMP 是细胞在损伤时脱落的球形结构（磷脂囊泡），直径 0.1～1μm；它的外膜存在各类携带亲代细胞特异性表面抗原的表面蛋白,CD144(VE-钙粘蛋白)就是其中之一[12]。而ABO 血型是人类最重要的血型系统，凝集原A和凝集原B 抗原广泛存在于人体多种组织器官中，这些抗原在内皮细胞表面呈强阳性表达[13]。本研究显示，血管损伤的生物标志物之一的EMP 与多个溶血相关指标独立相关,提示内皮损伤与溶血性疾病相关。

表1 三组患者一般信息比较

表2 治疗前EMP与临床参数多因素回归分析结果

研究发现, 传统Coombs 试验作为ABO-HDN新生儿的诊断价值有限，敏感性较低。急需找到更敏感和具有预后价值的标志物。它与健康对照组相比，ABO-HDN 组和Rh-HDN 组新生儿的血红蛋白水平显著降低，网织红细胞计数显著升高，并且Rh-HDN 组新生儿网织红细胞计数高于ABOHDN 组新生儿。此外，Rh-HDN 组新生儿 Coombs试验均呈阳性，ABO-HDN 组新生儿直接和间接Coombs 试验阳性率则显著低于Rh-HDN 组新生儿。这些结果表明，ABO-HDN 和 Rh-HDN 新生儿均存在血管内溶血,这与既往的研究结果相符[14,15]。Herschel 等的研究显示，ABO-HDN 新生儿中Coombs 试验多为阴性，仅3.5%的患者Coombs 试验为阳性，且多为呈弱阳性[16]。

CD144 作为EMP 中的代表蛋白，已发现其在糖尿病、冠心病、缺血性卒中和终末期肾病等多种疾病患者中均显著升高[17]，据此可预测为内皮细胞损伤。本研究显示，ABO-HDN 和 Rh-HDN 组新生儿的EMP 水平显著高于健康对照组，ABO-HDN组新生儿的EMP 水平绝对值高于Rh-HDN 组新生儿，但二者之间无显著统计学差异。这提示抗A凝集素和抗B 凝集素与内皮细胞表面抗原的相互作用可导致内皮细胞损伤和EMP 水平升高。

既往的研究显示，ABO 抗原在血管内皮细胞表面高表达，但Rh 抗原则在内皮细胞表面无表达[17]，这提示Rh-HDN 中的抗原抗体反应只发生在红细胞表面，由此导致的溶血反应可间接导致血管内皮细胞损伤,而ABO-HDN 中抗原抗体反应在血管内皮细胞和红细胞表面均可发生,由此可直接导致更为明显的内皮细胞损伤，Awad 等人的研究也表明ABO-HDN 新生儿的内皮细胞更为明显[3]，但目前在中国人中尚缺乏一定的研究[18]。Ataga 等研究显示，镰刀形红细胞贫血症患者血浆EMP 水平显著升高，并与多个溶血标志物显著相关[19]。此外，阵发性夜间血红蛋白尿患者外周血EMP 水平也显著升高[20]。本研究显示，ABO-HDN 新生儿治疗前EMP 水平与血红蛋白水平呈负相关，多因素回归分析显示，ABO-HDN 新生儿血浆EMP 与血红蛋白、LDH 和间接胆红素独立相关，而Rh-HDN新生儿血浆EMP 与血红蛋白和LDH 独立相关。

综上所述, 本研究从与传统实验预后预测对比, 以及ABO 抗原位置分布和溶血前后相关因素三方面分析，显示EMP 检测可能是ABO-HDN 新生儿的一个可靠的生物标志物和检测指标，为早期监测ABO-HDN 新生儿血管内皮细胞损伤提供了一个新的方法。