宫颈癌癌组织中miR-365、miR-135a-5p及STAT3 的表达水平及意义

蔡晓磊，熊丽丽，梁静

（河南科技大学第一附属医院1.妇科，2.病理科；河南 洛阳 471000）

全球每年新增宫颈癌患者约80%的自发展中国家，对女性生命健康产生严重威胁，该病病因与人乳头状瘤病毒 （Human papilloma virus，HPV）感染、早婚、早育、多产等多种因素相关，临床主要以放化疗辅助根治性手术为主要治疗手段，5 年生存率较高[1-3]。miRNA 调控人类30%的人类基因，与宫颈癌的发生发展关系密切，可以在体液中被检测到，有潜力成为疾病治疗的靶点[4-6]。有研究[7-9]指出，miR-365 通过抑制细胞增殖参与肿瘤发生；miR-135a-5p 在头颈癌中靶向作用于HOXA10，通过降低其活性来抑制肿瘤增殖；STAT3 属于癌基因的一种，与肿瘤细胞增殖、 转移等过程联系紧密。但三者在宫颈癌中的作用尚未明确，本研究宫颈癌组织中测定 miR-365、STAT3、miR-135a-5p表达，评估三者与临床病理学参数及预后的关系，希望为患者治疗方案的选择、 宫颈癌的发展机制提供数据参考，报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取 2016 年 6 月-2018 年 7 月在医院行宫颈癌手术切除的存档蜡块和癌旁正常组织（距病变部位＞5cm 处，且证实为无癌浸润）石蜡标本各90 例作为研究对象。癌组织和癌旁正常组织全部取样于女性,年龄 42～72 岁,平均 56.64±6.09岁；FIGO 分期：I 期 5 例，II 期 39 例，Ⅲ期 33 例，Ⅳ期 13 例；病理类型：鳞癌 78 例，腺癌 12 例。

1.2 纳入及排除标准 纳入标准：⑴经细胞学及组织病理学确诊为宫颈癌，可以明确肿瘤大小、部位、浸润程度；⑵无放化疗治疗史；⑶本研究经医院伦理委员会审批，患者及其家属对本研究知情同意。排除标准：⑴孕妇；⑵合并其他恶性肿瘤；⑶患有血液系统疾病或传染病等； ⑷伴随肺间质疾病或严重肝肾功能障碍；⑸生存期＜3 个月。

1.3 检测方法

1.3.1 免疫组化 取4μm 厚石蜡组织切片行常规HE 复染，经烤片、脱蜡、水化后，行抗原热修复，阻断内源性过氧化物酶，再行封闭非特异性结合，每张切片滴加 100μl 鼠抗人 STAT3（1:100）单克隆抗体（由美国Santa Cruz 公司提供），将切片置于室温下孵育1h，随后在每张切片上滴加100μL 新鲜配制的DAB 显色溶液 （加拿大Ferrmentas 公司提供），于多功能显微镜（上海茸研仪器有限公司）下观察显色情况，以PBS 代替一抗作为阴性对照，已知的STAT3 阳性标本为阳性对照。判定标准[10]：观察高倍 （×400） 视野下阳性细胞百分数及染色强度，阳性细胞占比≤5%为0 分、占比为6%~25%计1 分、 占比 26%~50%计 2 分、 占比 51%~75%计 3分、占比≥76%计4 分；细胞未染色计0 分、淡黄色为1 分、棕黄为2 分、棕褐为3 分，总分=细胞染色评分×细胞占比评分，总分≥3 分即为阳性表达。结果评判由2 人进行双盲读片确定。

1.3.2 qPCR 检测 收集全部研究对象存档蜡块中的宫颈组织100mg, 在液氮保护下研磨, 与1ml TRIzoI、200μl 氯仿混合后进行离心，通常 RNA 分布于上层无色水相中； 取上层液进行RNA 沉淀，管底出现白色沉淀，将获得的白色沉淀进行洗涤和溶解，DU800 型分光光度计测定RNA 的浓度及纯度；随即进行逆转录反应，将获得的逆转录产物保存于-20℃的冰箱中。实时定量荧光聚合酶链反应 （Real time quantitative polymerase chain reaction，qPCR） 技术检测 miR-365、miR-135a-5p 水平，PCR 引物合成由英潍捷基（上海）贸易有限公司提供，PCR 引物序列 miR-365、miR-135a-5p 分别 为 ：5' -CGTAATGCCCCTAAAAAT -3'；5' -ACACTCCAGCTGGGGTGCATTGTAGTTGCA-3'。内参照基因为U6 RNA。严格按照Access RT-PCR System 试剂盒说明书进行操作。由SDS 软件计算每个样品和内参的Ct 值，△Ct=Ct 目标基因-Ct 内参基因，受试者 miRNA 的相对表达水平=2-△△Ct。

1.4 观察指标 ⑴miR-365、miR-135a-5p 及STAT3 在宫颈癌组织和癌旁正常组织中的表达；⑵收集90 例宫颈癌患者临床资料,包括年龄、肿瘤分化程度、FIGO 分期、淋巴结转移、浸润深度、肿瘤直径及类别情况，分析 miR-365、miR-135a-5p 及STAT3 表达与宫颈癌临床病理参数间的关系；⑶miR-365、miR-135a-5p 及 STAT3 的相关性分析；⑷对90 例宫颈癌患者通过电话或门诊的形式随访2 年，末次随访时间为2020 年7 月，统计患者2年生存情况，ROC 曲线分析miR-365、miR-135a-5p 及STAT3 表达对宫颈癌患者的预后预测价值。

1.5 统计学方法 数据分析采用SPSS 18.0 统计软件，计数资料以率（%）表示，采用 χ2检验；计量资料采用（±s）表示，采用 t 检验，采用 Pearson 相关性分析研究 miR-365、miR-135a-5p 及 STAT3 之间的相关性，采用受试者工作曲线（Receiver operating characteristic curve，ROC）评估各指标对预后的预测价值，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-365、miR-135a-5p 及 STAT3 在宫颈癌组织和癌旁正常组织中的表达 miR-365 在宫颈癌组织中的相对表达量低于癌旁组织，miR-135a-5p的相对表达量、STAT3 的阳性表达率均高于癌旁组织（P＜0.05），见表1。

2.2 miR-365、miR-135a-5p 及 STAT3 表达与宫颈癌临床病理参数间的关系 FIGO 分期Ⅲ~Ⅳ期、合并淋巴结转移、高分化、直径≥5cm 的宫颈癌组织中miR-365 相对表达量分别高于FIGO 分期I~II期、未合并淋巴结转移、低分化、直径＜5cm 的宫颈癌组织（P＜0.05）；FIGO 分期Ⅲ~Ⅳ期、合并淋巴结转移的宫颈癌组织中miR-135a-5p 相对表达量分别高于FIGO 分期I~II 期、未合并淋巴结转移的癌组织（P＜0.05）。但不同年龄、肿瘤类型、浸润深度的宫颈癌组织中 miR-365、miR-135a-5p 及 STAT3的相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

2.3 miR-365、miR-135a-5p 及 STAT3 的相关性分析 宫颈癌组织中miR-135a-5p 的表达与STAT3呈显著正相关(r=0.388，P=0.000)，miR-365 与 miR-135a-5p、STAT3 无显著相关性（P＞0.05），见表3。

2.4 miR-365、miR-135a-5p 及 STAT3 表达与宫颈癌患者预后的关系 90 例宫颈癌患者2 年总生存率为66.67%（60/90），生存组患者宫颈癌组织中miR-365 的相对表达量高于死亡组；miR-135a-5p相对表达量低于死亡组（P＜0.05）。ROC 曲线分析显示 miR-365、miR-135a-5p 及 STAT3 的曲线下面积（Area under curve，AUC）分别为 0.855、0.735、0.549，选取 miR-365、miR-135a-5p 最佳截断点分别为 0.70、8.98，miR-365、miR-135a-5p 对宫颈癌患者预后情况有一定的预测价值,见表4、表5、图1。

表1 miR-365、miR-135a-5p及STAT3 在宫颈癌组织和癌旁正常组织中的表达

表2 miR-365、miR-135a-5p及STAT3 表达与宫颈癌临床病理参数间的关系

表3 miR-365、miR-135a-5p及STAT3 的相关性分析

表4 生存组和死亡组患者宫颈癌组织miR-365、miR-135a-5p及 STAT3 表达

表5 miR-365、miR-135a-5p及STAT3 表达与宫颈癌患者预后的关系

图1 miR-365、miR-135a-5p及STAT3 预测宫颈癌患者预后的ROC曲线

3 讨论

宫颈癌是一种发病率居第二位、 死亡率居首的女性生殖系统恶性肿瘤，近年来发病呈年轻化，约有30%的患者在接受治疗后仍出现病情恶化[11]。mi-RNA 是一类非编码单链小分子，参与多种疾病过程，同时调控细胞分化、免疫应答等多种过程，存在于易提取的外周血循环系统中，对于疾病的无创诊断、评估患者预后的应用中有很大潜力[12]。

miR-135a-5p 多作为抑癌基因调控肿瘤细胞增殖[13]，本研究中，miR-135a-5p 在宫颈癌组织中的相对表达量显著高于癌旁组织,且与宫颈癌淋巴结转移、FIGO 分期密切相关，以上结果提示miR-135a-5p 参与了宫颈癌的发展过程。既往研究[14]在宫颈癌组织中发现STAT3 呈高表达，且与淋巴结转移、FIGO 分期、浸润深度等病理特征相关，这与本研究结论不一致，本研究中，STAT3 在90%的宫颈癌组织中呈阳性表达，与年龄、FIGO 分期、浸润深度等各项病理参数均无相关性，考虑原因：研究中的样本容量不同、检测手法不同，均会对结果产生一定影响。通过相关性分析，本研究发现宫颈癌组织中miR-135a-5p 的表达与STAT3 呈显著正相关，与既往研究[15,16]一致，提示miR-135a-5p 是一个有潜力的宫颈癌治疗靶点，通过调节其靶基因的表达，对STAT3 及其下游信号通路进行调节，从而抑制细胞的恶性转化及增殖过程。

miR-365 在胃癌、宫颈癌等肿瘤中起到抑癌作用,有作为新型治疗靶点及分子标志物的潜力[17],本研究在宫颈癌组织中发现miR-365 的相对表达量低于癌旁组织，同时与宫颈癌的FIGO 分期、淋巴结转移、肿瘤直径、分化程度密切相关，提示miR-365 与宫颈癌的增殖、转移过程相关。研究[18]通过对宫颈癌组织中miR-365、E74 样受体(ELF4)的检测，发现miR-365 可以负靶向调节ELF4，通过解除ELF4 的抑制作用，促进癌细胞的增殖，二者与肿瘤大小、分化程度、FIGO 分期均密切相关。同时，本研究中发现，miR-365、miR-135a-5p 的相对表达量与宫颈癌患者短期预后有相关性，提示二者对宫颈癌患者的预后情况有一定的预判价值；但STAT3 的阳性表达率对宫颈癌患者预后的预测价值不大，这可能是因为本研究中90%的宫颈癌组织均呈STAT3 阳性表达。本研究为回顾性研究，难以避免选例偏倚，有待继续扩大样本容量，进行前瞻性、随机性研究，探究三者在宫颈癌组织中的表达及临床意义。

综上所述，miR-365、miR-135a-5p、STAT3 在宫颈癌组织中的异常表达，miR-365、miR-135a-5p与肿瘤临床病理学指标密切相关，其中miR-135a-5p 的表达与STAT3 具有显著相关性,由此推测，三者与宫颈癌的发生过程相关，miR-365、miR-135a-5p 可以用于评估患者预后情况。