甘薯基腐病病原菌分离鉴定及对甘薯品种的致病性测定
2021-05-18冯晓晓许燎原周小军郑永利
冯晓晓，许燎原，周小军，郑永利
(1.浙江大学 农业试验站，浙江 杭州 310058；2.宁波市农业技术推广总站，浙江 宁波 315012；3.金华市农业科学研究院，浙江 金华 321017；4.浙江省农产品质量安全中心，浙江 杭州 310003)
甘薯(IpomoeabatatasL.)是旋花科甘薯属的一个栽培种，又称为番薯、白薯、红薯、地瓜、山芋等，是我国的主要旱粮作物之一，也是重要的鲜食作物。随着城乡居民生活水平的提高，为适应多元的消费需求，高淀粉、高花青素、高胡萝卜素、高蛋白等加工型和鲜食型甘薯品种广泛种植。目前浙江省种植较广的甘薯品种，如有加工粉丝性能佳的中晚熟品种浙薯13、早熟迷你型鲜食品种心香、加工和鲜食兼用型的甘薯品种浙薯77、高产品种浙薯38等。甘薯基腐病在1913年被Harter首次报道[1]，2016年盖云鹏等[2]报道了浙江省三门县的甘薯基腐病，2018年余继华报道了浙江省台州市的甘薯基腐病[3]。2018—2019年，作者在浙江省宁海县的病害调查中发现，收获前期甘薯上有大量茎基部干腐褐化的病株，对甘薯产量造成毁灭性的影响。现将甘薯基腐病病原菌分离鉴定及对甘薯品种的致病性测定结果总结如下。
1 材料与方法
1.1 样本采集
2017年8月1日在浙江省宁海县进行甘薯基腐样品采集，样品具有典型的茎基部黑褐色干腐、褐化干枯的发病植株。用铲子从土壤中挖取带有10 cm土壤和根系的病株，置于样品袋中，于4 ℃保存。
1.2 病原菌分离纯化
参考方中达《植病研究方法》[4]。挑取发病部位的黑色子实体(分生孢子器)置于无菌水中，将分生孢子洗下配成分生孢子悬液，将分生孢子悬液在含有50 mg·L-1氯霉素的PDA培养基平板划线，于25 ℃下培养，挑取单菌落转移至新的PDA培养基上进行纯化，获得纯培养菌株。
1.3 病原菌形态鉴定
挑取病组织上的子实体，在显微镜下观察分生孢子的形态；将纯培养菌株ZJUP0002在PDA培养基上25 ℃恒温培养7～30 d，观察菌落形态。
1.4 病原菌分子生物学鉴定
1.4.1 基因组DNA提取
挖取PDA培养基上生长旺盛的纯培养菌株ZJUP0002菌块，置于2 mL离心管中，加入适量石英砂和DNA提取缓冲液，组织研磨仪60 Hz破碎120 s，9 000 r·min-1离心10 min，上清转移至新的离心管，加入300 μL异丙醇沉淀DNA，上下颠倒数次，12 000 r·min-1离心10 min，去上清，加入0.8 mL 70%乙醇洗涤，12 000 r·min-1离心2 min，去上清，37 ℃温育15 min，加入50 μL dd H2O，溶解基因组DNA。
1.4.2 PCR扩增和测序
用引物ITS1和ITS4扩增ITS序列，PCR体系25 μL。PCR扩增条件为95 ℃预变性2 min，95 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。PCR产物送至杭州擎科梓熙生物技术有限公司测序。
1.4.3 序列比对及分子生物学分析
将测序结果在NCBI GenBank 数据库进行序列同源性比对，从数据库下载相似度高的相应序列，采用MEGA 6.0进行多序列联配，并采用IQTREE以最大似然法(maximum likelihood, ML)进行系统发育分析，利用自展法(bootstrap)检验各分支的支持率。
1.5 病原菌对不同品种甘薯的致病性测定
纯培养菌株ZJUP0002在PDB培养基中培养5 d，过滤菌丝体，并用无菌水将菌丝体冲洗数次，重新悬浮在无菌水中，并将菌丝体打碎制备菌丝悬浮液。选取心香、浙薯13和浙薯77等3个甘薯品种的盆栽苗，将菌丝悬浮液接种至已培养30 d的健康甘薯茎基部土壤中，每盆接种10 mL，以清水为对照，观察和记录不同甘薯品种发病情况。发病后的植株再次用上述方法分离病原菌并进行菌株鉴定。
2 结果与分析
2.1 病原菌形态学特征
挑取发病部位的病原菌分生孢子器进行镜检。由图1可见，分生孢子单细胞，无色透明，椭圆形，两端各有一个油球，大小6～9 μm×3～4 μm。纯培养菌株ZJUP0002在PDA培养基上菌落呈不规则形，初白色，后变成灰白色至浅褐色，菌丝稀疏平铺在培养基上，在PDA培养基上培养30 d未见分生孢子器产生。在扫描电子显微镜下可见，菌丝束状、有隔、多缠绕。
a为PDA培养30 d的菌落形态；b为病组织上的分生孢子；c为扫描电镜下的菌丝。
2.2 病原菌对不同甘薯品种的致病性测定
甘薯基腐病在田间自然发病如图2所示。以扦插法培育心香、浙薯13和浙薯77盆栽苗，在盆栽基质接种病原菌菌丝悬浮液，每盆接种10 mL，以清水为对照，观察和记录不同甘薯品种发病情况。约14 d在茎基部出现褐化病斑，甘薯块根变褐色，如图2中c所示，上部分为发病的3个品种的块根，下部分为对照的3个品种的块根。发病植株生长缓慢并枯死(图2中 d)，从左到右为心香、浙薯13和浙薯77，尤其是心香和浙薯13，基本全株死亡，相对而言，浙薯77抗性较好；而对照组依然生长正常。发病后的植株再次用上述方法分离病原菌，分离到的病原菌标记为ZJUP0133，并进行菌株鉴定。
a为田间自然发病，b为接种ZJUP0002的茎部组织出现褐色病斑，c为心香、浙薯13和浙薯77接种和对照的甘薯块根对比图，d为心香、浙薯13和浙薯77接种和对照的甘薯植株对比图。
2.3 病原菌分子生物学鉴定
对分离的菌株ZJUP0002和回接后分离的菌株ZJUP0133进行ITS rDNA序列测定，序列用BLAST进行同源性比对。基于ITS rDNA，利用MEGA 6.0对菌株ZJUP0002、ZJUP0133及GenBank已知的甘薯干腐病病原菌Diaporthebatatas代表性菌株进行序列比对，以DiaporthellacorylinaCBS 121124为外群，IQTREE构建ML系统发育树(图3)，从构建的ML系统发育树可以发现，病原菌ZJUP0002和回接后分离菌株ZJUP0133与Diaporthedestruens代表性菌株位于同一分支上，自举支持率92%。因此，将ZJUP0002鉴定为甘薯基腐病菌Diaporthedestruens。
图3 基于ITS的甘薯基腐病病原菌Diaporthe destruens ML系统发育树
3 讨论
甘薯基腐病是制约甘薯产业发展的因素之一，该病易发生在甘薯收获前夕，极大打击了种植户的信心，严重影响农民的经济收入。在生产上，甘薯基腐病在品种之间存在抗病性差异。林飞荣等[5]于2017年对浙江省台州市黄岩区上郑乡的30个甘薯品种发病情况进行调查发现，基腐病发病严重的品种病株率达90%，浙薯38等个别品种未发现病株，表现出较强的抗病性，可见品种之间抗病性差异极为显著。作者在浙江省金华市调查发现，全市甘薯种植面积约5 333 hm2，甘薯基腐病从2013年开始陆续发生，至2020年发病面积约1 333 hm2，尤以婺城区塔石乡发病较重，70%以上田块有发病，减产30%～40%，严重地块甚至绝收。大部分品种感病，浙薯38和浙薯255发病较轻。
本文通过分离甘薯基腐病病原菌，将病原菌接种至浙江省3个种植较广的甘薯品种浙薯77、浙薯13和心香，3个甘薯品种均发生基腐症状。其中，浙薯13和心香发病较重，浙薯77具有较好的抗性，由此证明，不同品种甘薯对基腐病的抗性具有差异。因此，有必要对浙江省现有栽培的甘薯品种以及今后在品种选育中进行甘薯基腐病的抗性鉴定，明确不同甘薯品种对基腐病的抗性。
甘薯基腐病的来源是种苗，可借助伤口侵染茎和块根。在发病田块，农民常因甘薯无收成而任其在田间腐烂，病原菌在病残体上飞快繁殖，在来年的种植中引发更重的病害。因此，在田间管理上，清园和避免连作显得尤为重要。另外，林飞荣等[5]提出，采用无病种苗、土壤消毒和甘薯生长期喷药预防对控制病害有显著效果。喷药与推迟扦插可延迟发病时间，选择相对抗性较好的品种种植，是避免大面积发生甘薯基腐病的有效方法之一。
