发酵时间对安岳坛子肉风味及坛内细菌菌群结构的影响

肖 岚， 安攀宇， 杨 芳， 何 莲， 杜双巧， 曾小婷， 刘 威

（四川旅游学院 食品学院，四川 成都610100）

四川安岳坛子肉是将油炸之后的猪五花肉用香辛料调味，然后与萝卜丝一起入坛发酵而形成的发酵肉制品，因入陶坛中发酵而成名，故名坛子肉。坛子肉的酱香风味浓郁，这应该与其入坛发酵密切相关，陶坛内特有的细菌菌群结构通过自身新陈代谢对坛子肉进行发酵，发酵过程中产生各种风味物质，如酯类、烷烃类、醇类、醛类、酮类、酚类等化合物[1]，形成了坛子肉的特殊风味。 目前，国内学者对发酵肉制品的微生物菌群结构变化与风味关系的研究主要集中在湖南坛子肉[2]、汉源罐罐肉[3]、发酵火腿[4-5]、发酵香肠[6-7]、发酵腊肉[8-9]、发酵鱼[10]。在本研究的前期实验中，关于发酵温度对坛子肉挥发性风味物质的影响进行了研究[11-12]，萝卜丝入坛发酵对坛内细菌菌群结构演替变化的影响[13]、发酵终点对坛子肉细菌群落结构的影响也进行了研究[1]。 然而，发酵终点前以及发酵终点后的坛内细菌菌群结构变化、坛子肉风味变化暂未有系统研究。 在坛子肉的实际生产中，坛子肉发酵终点的确定是根据有经验的老师傅进行感官评价的结果，不同季节、不同陶坛制备的坛子肉的发酵终点差异较大，比如坛子肉冬季发酵终点一般在60～80 d 内，夏季发酵终点一般在45～60 d 内。 生产企业为了提高生产效率，只要达到坛子肉风味的基本要求，企业即会停止其发酵，关于延长发酵时间的坛子肉的风味轮廓以及坛内细菌菌群结构变化暂未有报道。 因此，为系统了解发酵时间对安岳坛子肉风味以及坛内细菌菌群结构的影响，作者制备了发酵时间长达135 d 的坛子肉样品以进行动态研究， 利用Illumina MiSeq高通量测序平台对坛内的坛子肉、萝卜丝的细菌菌群结构进行检测，并使用电子鼻、电子舌对不同发酵时间节点的坛子肉的风味轮廓进行比较分析，获得不同发酵时间节点的坛子肉风味以及坛内细菌菌群结构的差异关系，为详尽了解发酵时间与坛子肉风味、坛内细菌菌群结构的关系提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

DNA 提取试剂盒（E.Z.N.A.®Stool DNA Kit）：上海哈研生物科技有限公司；坛子肉：由四川安岳县普州坛子肉食品有限公司代生产（按照冬季生产工艺生产[1]，分别在入坛发酵第20、40、60、75、90、105、120、135 天进行取样，经真空包装后保存于-80℃，备用）；萝卜丝：在发酵第20、40、60、75、90、105、120、135 天时与坛子肉一起从坛内取出， 经真空包装后保存于-80 ℃，备用；MiSeq Reagent Kit V3：美国Illumina 公司。

1.2 仪器与设备

MiSeq 测序仪：美国Illumina 公司；α-Astree 型电子舌：法国Alpha MOS 公司；AUW220D 电子天平（精度为0.1 mg）： 日本岛津公司；FOX4000 系统电子鼻：法国Alpha MOS 公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA 提取和测序 参考肖岚[1]等的方法提取坛子肉、 萝卜丝样品中细菌的总DNA， 并对DNA纯度、 DNA 浓度进行检测、扩增（扩增的目标区域是16S rDNA 基因的V3+V4 区域）[14]、测序。

1.3.2 坛子肉风味属性的感官评定 感官评定参考美国化学协会规定的方法[15]。 评定小组由受过专业培训的感官评定人员组成，共10 人，男女各半，分别从酱香、肉鲜、肉酸、余味残留、整体风味5 个角度打分，具体标准如下：风味特别强烈（9～10 分）；风味强烈（6～8 分）；风味中等（4～6 分）；风味较弱（2～4 分）；风味可无可有（0～2 分）[16]。

1.3.3 坛子肉电子舌和电子鼻测定 电子鼻分析：参照易宇文[17]等的方法，准确称量2.0 g 坛子肉并充分切碎，置于顶空瓶，密封，用于电子鼻测试。

电子舌分析：参照范文教[18]等的方法，将20.0 g坛子肉充分切碎， 置于锥形瓶中并加入200 mL 蒸馏水，超声波处理10 min，经普通滤纸过滤去上清液，收集80 mL 用于电子舌测试。

1.3.4 数据处理 试验数据经3 次平行试验后得到。 电子鼻、电子舌检测数据采用Alpha MOS 公司配套统计分析软件进行判别因子分析[19]。 坛内细菌菌群Miseq 测序完成后， 利用overlap 对数据进行处理，获得最终的OTU 丰度及代表序列，并进一步进行多样性分析、物种分类注释和差异分析[20]。

2 结果与分析

2.1 ?坛内细菌Alpha 多样性分析

为了解在发酵过程中坛内的细菌变化规律，对不同发酵时间的坛子肉、萝卜丝细菌菌群结构进行了分析。 不同发酵时间的各样品的Alpha 多样性指数见表1。 菌群覆盖度指数（Goods coverage）反映测序量相对于整体样本的覆盖程度[21]。 本次16 组样品的菌群覆盖度指数均能达到98% 以上。 Chao1指数用于估计样品中所含 OTU 数目，OTUs（Operational Taxonomic Units） 是将16 组样品获得的有效序列数（ 38 247 条）按照97% 的序列相似度进行聚类[22]，得到每个cluster 的序列及其代表序列即为OTU。

发酵60 d 坛子肉、 萝卜丝的平均Chao1 指数均最高，分别为596.35、585.05，说明其含有的稀有群落的丰富度最高， 发酵105 d 坛子肉的稀有群落的丰富度也较高（Chao1 搦数596.10）。坛子肉、萝卜丝的observed species 指数随发酵时间延长呈先上升后下降的变化趋势，其中，发酵60 d 坛子肉、萝卜丝的平均observed species 指数均最高， 分别为412.33 和345.33， 样品中含有的物种数目最多。Simpson 指数越高反映样品物种多样性越高， 发酵90 d 坛子肉、发酵120 d 萝卜丝的Simpson 指数最高；Shannon 指数越高反映OTU 出现的紊乱和不确定性越高，发酵60 d 坛子肉、萝卜丝的Shannon 指数均最高。 由以上结果可知，发酵60 d 的坛内样品（包括坛子肉和萝卜丝） 的细菌菌群丰富度和多样性高于其他发酵时间样品，说明发酵促进了坛内细菌的生长繁殖；发酵75 d 时，坛内菌群丰富度和多样性开始下降，且在随后的发酵时间内呈波动下降趋势。

2.2 坛内细菌菌群结构差异的比较

不同颜色的树枝代表不同样品组， 如图1 所示，不同发酵时间的坛子肉以及萝卜丝在细菌菌群结构上有较大差异。 大部分坛子肉样品与大部分萝卜丝样品分别位于两个不同的分支，然而，发酵60、120 d 萝卜丝在坛子肉分支中，发酵75 d 坛子肉在萝卜丝分支中， 说明发酵60、120 d 的萝卜丝与其他发酵时间的萝卜丝在细菌菌群结构上有较大差异， 发酵75 d 坛子肉与其他发酵时间的坛子肉在细菌菌群结构上有较大差异。 另外， 60 d 坛子肉与其他发酵时间的坛子肉不在一个分支， 说明60 d坛子肉与其他发酵时间的坛子肉在细菌菌群组成上存在差异； 20 d 萝卜丝与其他发酵时间的萝卜丝不在一个分支， 说明20 d 萝卜丝与其他发酵时间的萝卜丝在细菌菌群组成上存在差异。 综上，发酵时间少于或多余60 d 的坛子肉与发酵60 d 的坛子肉在细菌菌落组成上差异较大，而坛子肉生产企业在冬季的生产发酵时间一般控制在60 d 左右，说明60 d 发酵时间是坛子肉风味质变的一个关键节点。

表1 坛内细菌菌群丰富度和多样性指数Table 1 Bacterial Community Richness and Diversity Index in the Tank

图1 UPGMA 层次聚类分析Fig. 1 UPGMA Hierarchical C?lustering Analysis

2.3 坛内细菌菌群的物种注释

为了直观展现物种分类及样品距离之间的关系， 对丰度前20 的物种进行Bray-Curtis 距离聚类，如图2 所示[1]。细菌菌群在种水平相对丰度最高的是乳酸杆菌属（Lactobacillus），各发酵时间的坛子肉相对丰度均达到99%以上； 然而在发酵20、40 d的萝卜丝中，乳酸杆菌属的相对丰度较低，分别为88.17% 和94.97%，但随发酵时间的延长，乳酸杆菌丰度增加（P＞0.05），萝卜丝发酵60 d 后的乳酸杆菌相对丰度均达到99% 以上。 蓝细菌属（Streptophyta）在发酵20 d 萝卜丝中的相对丰度达到7.47%，40 d萝卜丝中的相对丰度是4.50%， 其他各发酵时间的萝卜丝以及所有发酵时间的坛子肉中的相对丰度均未超过1%。 伯克氏菌属（Burkholderia）仅在发酵20 d 萝卜丝中的相对丰度超过1%。 其他各菌属的相对丰度在各样品中均不超过1%。 以上结果提示，乳酸杆菌属是安岳坛子肉中第一优属，然而前人多报道葡萄球菌[8]、乳球菌属[9-10]也是发酵肉制品常见的优势菌属，这可能与安岳坛子肉独特的加工工艺有关，即坛子肉、萝卜丝混合入坛发酵，因此坛子肉具有独特的酱香风味。

为了更直观反映多个样品在各分类水平上组成的相似性和差异性，根据各样品相对丰度表对相对丰度最高20 个的菌群组成数据的相似度加以聚类，见图3[1]。 从图3 可以看出，60 d 坛子肉与40 d坛子肉聚类最近，说明其菌群组成较为相似；另外，60 d 坛子肉与90 d 坛子肉、75 d 坛子肉虽在同一分支，但是聚类较远，特别是与75 d 坛子肉的聚类更远。此外，105 d 坛子肉与105 d 萝卜丝的聚类最近， 90 d 坛子肉与120 d 萝卜丝的聚类最近，说明其菌群组成最相似。以上结果提示，40、60、75、90 d坛子肉在属水平上聚类较近， 特别是60 d 坛子肉与40 d 坛子肉；随着发酵时间的延长，坛子肉在属水平上聚类变远；另外，随着发酵时间延长，坛子肉与萝卜丝在属水平聚类上趋于稳定，也就是陶坛中的坛子肉、 萝卜丝所携带的细菌菌群结构趋于一致。

图2 各样品在属水平的丰度柱状图Fig. 2 Abundance histogram of each sample at genus level

2.4 发酵时间对坛子肉特殊风味的影响

如表2 所示， 各坛子肉样品的酱香味非常浓郁，其中90 d 坛子肉酱香味的评分最高，为9.75；各坛子肉样品的鲜味不明显，可能是浓郁的酱香味掩盖了其鲜味，60 d 坛子肉的鲜味评分最高，为5.92；各坛子肉样品的酸味似有似无，可能正是酸味使坛子肉吃起来肥而不腻，135 d 坛子肉的酸味评分最高，为3.04；试验中评定的酱香味、鲜味、酸味以及整体风味都是坛子肉的头香，而余味残留是指品尝完坛子肉后嘴里余留的香味，60 d 坛子肉余味残留评分最高，为7.43。 风味与风味之间会发生相互作用从而相互影响，这就需要对坛子肉的风味进行综合评价，即整体风味。 整体风味评分最高的是60 d 发酵坛子肉，发酵时间不足以及过度发酵都会影响坛子肉的整体风味，其中，发酵时间超过90 d的坛子肉的整体风味评分较低（P＜0.01），且发酵时间越长风味越差。 感官评价受品评员主观以及环境客观因素的影响较大，且目前暂时未有生产企业结束发酵后的坛子肉的风味研究数据。 作者将采用电子鼻、电子舌客观评价60、75、90、105、120、135 d 发酵的坛子肉的风味，见图3。

2.5 坛子肉电子舌、电子鼻风味指纹图谱分析

判别因子分析 （discriminant factorial analysis，DFA）[16]是将电子鼻、 电子舌的传感器数据重新组合，缩小组内样品变量差距，而组间样品变量差距尽可能扩大，达到区分各组样品的目的[23-25]。 各坛子肉样品的DFA 分析图见图4。在DFA （左）中60 d坛子肉与90 d 坛子肉在气味上的距离最近， 经多元方差分析（MANOVA）发现两者差异不显著（P＞0.05）；105 d 坛子肉与120 d 坛子肉在气味上的距离最近，差异不显著（P＞0.05）；其余各组间均有明显的离散趋势， 各组间差异显著 （P＜0.05）， 特别是135 d 坛子肉离散最远， 75 d 坛子肉次之。 以上结果说明， 发酵时间会对坛子肉的气味产生影响，长时间发酵的坛子肉（105 d 坛子肉与120 d 坛子肉）气味较为接近， 适度发酵坛子肉 （60 d 坛子肉与90 d 坛子肉） 气味较为接近； 135 d 坛子肉、 75 d坛子肉与其他坛子肉的气味差异较大[26]。

表2 不同发酵阶段的坛子肉的风味感官评定Table 2 Flavor sensory evaluation of Anyue ceramic-pot sealed meat at different fermentation stages

图3 各样品在属水平的热图Fig. 3 Thermogram of each sample at genus level

在DFA （右）中， 60 d 坛子肉与其他坛子肉在滋味上有明显的离散趋势， 差异极显著（P＜0.01）；105 d 坛子肉与120 d 坛子肉在滋味上的距离最近（P＞0.05）；其余各组间均有明显的离散趋势，各组间差异显著（P＜0.05）。以上结果显示，发酵时间也会对坛子肉的滋味产生较大影响。

综上，发酵时间会对坛子肉的风味产生较大影响，长时间发酵的坛子肉的风味较为接近，短时间发酵的坛子肉的风味较为接近。 在气味上， 135 d坛子肉、 75 d 坛子肉与其他坛子肉的差异较大（P＜0.01）；在滋味上， 60 d 坛子肉与其他坛子肉差异较大（P＜0.01）。

图4 不同发酵时间的坛子肉的DFA 分析图Fig. 4 DFA analysis of ceramic -pot sealed meat had different fermentation time

3 讨 论

Illumina MiSeq 高通量测序检测结果发现，发酵时间对坛内菌相产生较大影响。 根据OUT 丰度、细菌Alpha 多样性分析发现， 60 d 发酵的坛子肉及萝卜丝的细菌菌群丰富度和多样性均高于其他样品，说明发酵促进了坛内细菌的生长繁殖。 当发酵75 d 时，坛子肉、萝卜丝的菌群丰富度及多样性开始下降， 且在随后的发酵时间内呈波动下降趋势， 这与优势菌群大量繁殖抑制杂菌有密切关系，这在2.3 的试验结果中得到了证实。

根据2.2 的试验结果，75 d 坛子肉、40 d 萝卜丝的3 个样品中均有1 个样品离散在群体之外，这与试验过程中开坛取样有关。 为了确保坛内微生态环境的稳定， 在坛子肉生产企业的实际生产中，发酵终止前是不能开坛的。此外， 2.2 与2.3 的试验结果是一致的，即长时间发酵坛子肉（105、120、135 d）在菌群构成上较为相似， 适中发酵时间的坛子肉（40、60、90 d）在菌群构成上较为相似，而发酵75 d坛子肉与其他坛子肉在菌群构成上存在较大差异，因此推断，坛子肉发酵75 d 后若再继续发酵，其细菌菌群组成将发生较大变化，并影响其特殊风味的形成，这在2.4、2.5 的 试验结果中得到了证实。

坛肉细菌发酵产生酮醛酯等风味物质，赋予坛子肉特殊的风味。 为了解发酵时间对坛子肉风味的影响，首先采用坛子肉生产企业常用的感官评定法对不同发酵时间的坛子肉的风味进行评定，结果与企业的实际情况一致，不同发酵时间坛子肉在酱香味、鲜味、酸味、余味残留、整体风味均有明显差异。整体风味评分最高的是60 d 发酵坛子肉； 超过90 d 发酵时间的坛子肉的整体风味评分极显著降低（P＜0.01），且发酵时间越长风味越差。结合坛内细菌结构变化进行推断，坛内细菌菌群的改变影响了坛子肉的风味。 根据电子鼻、电子舌绘制的不同发酵时间坛子肉的风味指纹图谱，进一步证实了发酵时间对坛子肉风味的影响，即坛内细菌菌群影响坛子肉的风味。 在气味上，75 d 坛子肉与其他坛子肉的差异较大（P＜0.01）；滋味上， 60 d 坛子肉与其他坛子肉差异较大（P＜0.01）。综上，本试验结果与坛子肉生产企业的实际情况是相符合的，即坛子肉在冬季的生产发酵时间控制在60～75 d 内较为适宜。

4 结 语

乳酸杆菌属是坛子肉发酵过程中的优势菌属，始终保持在99% 以上。 坛子肉发酵60 d 时，坛子肉中细菌菌群结构的多样性最高；发酵75 d 时，坛子肉菌群多样性开始下降，且在随后的发酵时间内呈波动下降趋势。 发酵75 d 坛子肉与其他发酵时间的坛子肉在细菌菌群结构上有较大差异，随着发酵时间的延长，坛子肉中细菌菌群结构与萝卜丝细菌菌群结构差异变小。

发酵时间不仅坛子肉的细菌菌群结构变化，也会影响坛子肉的风味。 根据传统的人工感官评定结果，整体风味评分最高的是60 d 发酵坛子肉，发酵时间不足以及过度发酵都会影响坛子肉的整体风味。 电子鼻及电子舌分析发现，75 d 坛子肉与其他坛子肉在气味上的差异较大（P＜0.01）， 60 d 坛子肉与其他坛子肉在滋味上差异较大（P＜0.01）。

综上，坛内细菌菌群结构是与发酵时间密切相关的，细菌菌群结构的变化会影响坛子肉特殊风味的形成。 此外，坛子肉发酵过程中风味物质的种类及其含量尚未明确，本团队将继续深入研究，为坛子肉的标准化生产调控提供理论依据和数据支持。