添加酿酒酵母的类Cheddar 干酪生产工艺

李 莹， 刘 念， 沈晓艺， 马挺军， 孙爱东， 王 芳*，2，3

（1． 北京农学院 食品科学与工程学院，北京102206；2． 北京农学院 食品质量与安全北京实验室，北京102206；3． 北京农学院 农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室， 北京102206；4． 北京林业大学 生物科学与技术学院，北京100083）

干酪是以新鲜牛乳为原料，杀菌后添加发酵剂和凝乳酶使其凝固，再经排乳清、腌渍、压榨、成熟等工艺制成的发酵乳制品。 目前，我国年人均干酪消费量仅为0.1 kg， 与欧盟国家年人均干酪消费量18.7 kg 相比存在较大差距。 在乳品行业中，产品的感官特征是决定其市场和销售量的关键，其中风味是影响消费者对干酪产品接受度和喜好程度的最重要的属性之一[1]。 特色风味干酪的开发是近几年的研究热点[2-4]，例如研究学者利用红曲霉、酵母菌等作为辅助发酵剂提高干酪的风味[2-3]，将豆乳与牛乳混合后制作豆味浓郁的混合乳干酪[4]。

奶酒是我国北方游牧民族的传统发酵乳制品[5]，是一种以新鲜马奶（羊奶或牛奶）、蔗糖等为原料，分批或同时接入酵母菌和乳酸菌发酵而成的一种低醇度酒精乳饮料[6]。 Cheddar 干酪是我国最主要的天然干酪消费品类之一，是制作再制干酪的主要原料。将传统奶酒与Cheddar 干酪相结合，利用酿酒酵母制作牛奶酒，在此基础上进行发酵、凝乳、脱乳清和压榨处理等工艺加工类Cheddar 干酪产品， 有利于奶酒产品的推广，同时可以开发具有特色风味的干酪产品。 然而，目前关于此方面的研究尚属空白。

作者选取蔗糖添加量、 干酪发酵剂添加量、凝乳酶添加量为因素，以干酪产率和感官评定为主要检测指标，通过单因素实验和正交实验对添加酿酒酵母的类Cheddar 干酪的加工工艺进行优化， 为具有特色风味的干酪的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜牛乳： 蛋白质质量分数为2.97%～3.05%，脂肪质量分数为3.71%～3.94%， 抗生素检测为阴性，蒙牛乳业（北京）有限责任公司产品；蔗糖：广州福正东海食品有限公司产品； 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：活性干酿酒酵母，安琪酵母股份有限公司产品；凝乳酶：Stamix 1150，活力为2 235 IMCU/g，科汉森（中国）有限公司产品；干酪发酵剂：R-704 直投式发酵剂，科汉森（中国）有限公司产品。

无水乙醇、无水乙醚、石油醚等：均为分析纯，北京化工厂产品。

1.2 仪器与设备

DK-8B 水浴锅：中国精宏实验设备有限公司产品； 干酪槽和干酪压榨器： 作者所在实验室自制；DH-101-2 电热恒温鼓风干燥箱： 中国中环有限公司产品；DSHZ-300A 水浴恒温振荡器： 苏州培英实验设备有限公司产品；TMS-Pro 质构仪： 美国FTC公司产品；ME204 分析天平：梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司产品；CJ78-1 磁力搅拌器：常州市金坛大地自动化仪器厂产品；pHB-4 精密酸度计：上海仪电科学仪器有限公司产品；KDY-9830 全自动凯氏定氮仪：上海洪纪仪器设备有限公司产品。

1.3 方法

1.3.1 工艺路线 原料乳→标准化→添加蔗糖→灭菌 （90 ℃，15 min）→冷却至23 ℃→接种酿酒酵母（0.2 g/L）→酒精发酵（23 ℃，72 h）→接种干酪发酵剂→乳酸发酵（32 ℃，30 min）→添加氯化钙（0.2 g/L）→添加凝乳酶→凝乳 （32 ℃）→切割→匀速升温至39 ℃（5 ℃/min）→恒温蒸煮→排乳清→堆叠至pH 5.5→盐渍（3 g/L）→压榨（120 kg，12 h）→真空包装→成熟（4 ℃）。

取成熟1 d 的类Cheddar 干酪样品进行相关指标测定。

1.3.2 单因素实验

1） 蔗糖添加量的单因素实验 干酪发酵剂添加量为0.04 g/L，凝乳酶添加量为447 IMCU/L，其他条件不变，将蔗糖添加量分别设为40、50、60、70 g/L，测定蔗糖添加量对干酪产率、硬度以及感官评定的影响。

2） 干酪发酵剂添加量的单因素实验 蔗糖添加量为60 g/L，凝乳酶添加量为447 IMCU/L，其他条件不变， 将干酪发酵剂添加量分别设为0.02、0.04、0.06、0.08 g/L， 测定干酪发酵剂添加量对干酪产率、硬度以及感官评定的影响。

3） 凝乳酶添加量的单因素实验 蔗糖添加量为60 g/L，干酪发酵剂添加量为0.04 g/L，其他条件不变， 将凝乳酶添加量分别设为223.5、447、670.5、894 IMCU/L，测定凝乳酶添加量对干酪产率、硬度以及感官评定的影响。

1.3.3 正交实验 根据单因素实验选择出最优水平区间，进行三因素三水平正交实验，对类Cheddar干酪进行感官评定、干酪产率、pH 值、蛋白质回收率和脂肪回收率的测定。

1.3.4 最优工艺的验证实验 以感官评定为评价指标，对通过正交实验优化得到的最优工艺与正交实验表中感官得分最高的工艺进行验证实验。

1.3.5 干酪产率、蛋白质回收率及脂肪回收率测定干酪产率、蛋白质回收率及脂肪回收率测定参照文献[7]。

1.3.6 pH 值测定 取20 g 干酪溶于12 g 去离子水，研磨至无颗粒，使用酸度计测定[8]。

1.3.7 质构特性测定 采用TPA 测试对样品执行两次压缩循环，模拟口腔咀嚼过程。 将干酪样品切割成边长为15 mm 的立方体， 在4 ℃下贮藏过夜。测定参数：探头直径30 mm，测量过程中探头速度1 mm/s，压缩形变量75%，触发力5 g。

1.3.8 感官评定 感官评定见表1， 参考美国农业部不同等级Cheddar 干酪评价指标[9]，稍作修改。

1.4 数据分析

所有样品均重复测定3 次。 方差分析借助SPSS 17.0 完成；图表借助Origin 8.0 完成。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 蔗糖添加量对添加酿酒酵母的类Cheddar 干酪产率、硬度和感官评定的影响 干酪的产率是评价生产效益、考察生产参数合理性的重要指标[10]。奶酒发酵过程中， 酿酒酵母因为缺乏β-半乳糖苷酶，不能利用牛奶中的乳糖，因此本研究中添加蔗糖作为酿酒酵母的碳源。 由表2 可知，随着蔗糖添加量的增加，类Cheddar 干酪的产率显著降低（P＜0.05）。Hong 等人（2017）[11]研究不同乙醇体积分数对Camembert 干酪理化组分的影响， 认为添加不同体积分数乙醇的干酪间组分存在差异可能与加工工艺、发酵剂活性的改变有关。 同时，乙醇会导致牛乳中的酪蛋白胶束失去稳定性，发生聚集、形成沉淀[12]。 本研究中，随着蔗糖添加量的增加，酿酒酵母发酵产生更多的乙醇，干酪加工过程中凝乳时间和恒温蒸煮时间显著缩短，说明蛋白质网状结构可能是在凝乳酶诱导的酶凝作用和乙醇诱导的失稳作用下形成，后者形成的结构水分包裹能力差，造成干酪产率随蔗糖添加量增加而降低。

表1 添加酿酒酵母的类Cheddar 干酪的感官评定细则Table 1 Detailed sensory evaluation of Cheddar -like cheese with Saccharomyces cerevisiae

表2 蔗糖添加量对添加酿酒酵母的类Cheddar 干酪产率的影响Table 2 Effect of sucrose addition amount on yield of Cheddar -like cheese with Saccharomyces cerevisiae

质构特性是评价干酪品质和消费者接受程度的重要指标[13]，其中硬度是主要的评价指标。 由图1可知，随着蔗糖添加量的增加，类Cheddar 干酪的硬度显著增加（P < 0.05）。 研究表明，干酪中水分质量分数降低，蛋白质网状结构变得更加致密，导致硬度增加[14-15]。 与前人的报道一致，本研究中随着蔗糖添加量的增加，乳清排出量增加、干酪产量降低，进而引起蛋白质网状结构变得致密、硬度增加。

图1 蔗糖添加量对添加酿酒酵母的类Cheddar 干酪硬度的影响Fig. 1 Effect of sucrose addition amount on hardness of Cheddar-like cheese with Saccharomyces cerevisiae

由图2 可知， 蔗糖添加量对类Cheddar 干酪的气味、口感和滋味影响显著，对外观影响不显著。 气味方面， 添加40 g/L 蔗糖加工的干酪奶味更加浓郁； 添加70 g/L 蔗糖加工的干酪酒味更加浓郁；添加50 g/L 蔗糖加工的干酪酒香味和奶香味比例适中，得分最高。 口感方面，添加40 g/L 蔗糖加工的干酪质地较为绵软，缺少弹性；添加70 g/L 蔗糖加工的干酪口感粗糙；添加50 g/L 蔗糖加工的干酪质地软硬适中，口感细腻，得分最高。 滋味方面，添加40 g/L 蔗糖加工的干酪滋味过于平淡； 添加70 g/L 蔗糖加工的干酪产生过浓的发酵味、 酒精味以及苦味，随着蔗糖添加量的增加，酿酒酵母代谢产生的乙醇体积分数增加。 已有研究表明，乙醇是Cheddar干酪中酯类合成的限制性因素，乙醇体积分数与乙酯的形成密切相关，Cheddar 干酪中过多的乙酯会导致“果味”缺陷[6，16]；添加50 g/L 蔗糖加工的干酪乳酸味浓郁，配比适宜，得分最高。综合评定添加50 g/L蔗糖加工的干酪感官评分最高。

由以上实验可知， 添加50 g/L 蔗糖加工的类Cheddar 干酪产率较高，质地软硬适中，奶香味与酒香味比例适中，滋味醇厚。

图2 蔗糖添加量对添加酿酒酵母的类Cheddar 干酪感官评定的影响Fig. 2 Effect of sucrose addition amount on sensory evaluation of Cheddar -like cheese with Saccharomyces cerevisiae

2.1.2 干酪发酵剂添加量对添加酿酒酵母的类Cheddar 干酪产率、硬度和感官评定的影响 由表3可知， 干酪发酵剂添加量对类Cheddar 干酪产率无显著影响（P > 0.05）。 Cheddar 干酪加工过程中，发酵剂主要通过促进凝乳酶作用和凝块中乳清排出影响干酪品质[17]。本研究中，随着干酪发酵剂添加量的增加，干酪加工过程中凝乳时间和恒温蒸煮时间显著缩短， 说明干酪发酵剂的增加促进了凝乳作用，同时加快了pH 值的降低，这与Khosrowshahi 等人（2006）[18]的报道是一致的。但是，干酪发酵剂添加量引起的加工工艺的改变对干酪产率没有显著影响。

表3 干酪发酵剂添加量对添加酿酒酵母的类Cheddar 干酪产率的影响Table 3 Effect of cheese starter addition amount on yield of Cheddar -like cheese with Saccharomyces cerevisiae

由图3 可知， 随着干酪发酵剂添加量的增加，类Cheddar 干酪的硬度呈现先不变（P > 0.05）后显著降低（P < 0.05）的趋势。 研究表明，干酪中蛋白质网状结构特性、脂肪和水分的质量分数及分布状态是影响硬度的主要因素[19-20]。 本研究中，干酪发酵剂对干酪产率没有显著影响，但是对干酪硬度的影响显著，说明干酪发酵剂可能通过影响干酪中某些物质的含量及分布状态影响硬度， 这与Khosrowshahi等人（2006）[18]的研究中干酪发酵剂的增加造成了更小的断裂应力和应变的情况是一致的。

图3 干酪发酵剂添加量对添加酿酒酵母的类Cheddar 干酪硬度的影响Fig. 3 Effect of cheese starter addition amount on hardness of Cheddar-like cheese with Saccharomyces cerevisiae

由图4 可知， 干酪发酵剂添加量对类Cheddar干酪的气味和滋味影响显著，对口感和外观影响不显著。气味方面，添加0.04 g/L 干酪发酵剂加工的干酪有轻微奶香味和酒香味； 添加0.08 g/L 干酪发酵剂加工的干酪酸味过重； 添加0.06 g/L 干酪发酵剂加工的干酪得分最高， 酒香味和奶香味比例适中。滋味方面， 添加0.02 g/L 干酪发酵剂加工的干酪由于滋味平淡得分较低； 添加0.08 g/L 干酪发酵剂加工的干酪酸味过重；0.04 g/L 干酪发酵剂添加量的干酪酸度适宜，分数最高。综合评定添加0.04 g/L 干酪发酵剂加工的干酪感官评分最高。

由以上实验可知， 添加0.04 g/L 干酪发酵剂加工的类Cheddar 干酪产率高，酸度适宜，酸味与奶香味、酒味比例适中。

图4 干酪发酵剂添加量对添加酿酒酵母的类Cheddar 干酪感官评定的影响Fig. 4 Effect of cheese starter addition amount on sensory evaluation of Cheddar -like cheese with Saccharomyces cerevisiae

2.1.3 凝乳酶添加量对添加酿酒酵母的类Cheddar干酪产率、硬度和感官评定的影响 凝乳酶是以酶凝作用为主的干酪加工过程中必须的酶制剂[21]，主要参与凝块的形成和干酪成熟过程中蛋白质的降解。 由表4 可知， 随着凝乳酶添加量的增加，类Cheddar 干酪的产率先显著降低（P < 0.05）后基本不变（P > 0.05）。 本研究中，随着凝乳酶添加量的增加，干酪加工过程中凝乳时间先缩短后增加、恒温蒸煮时间显著增加（结果未展示），这与凝乳酶/酪蛋白底物比例的增加会加快κ-酪蛋白的酶切作用进而加速酪蛋白的聚集、缩短凝乳时间的现象[22]是矛盾的， 说明凝乳酶的酶切作用受到某种因素的抑制。 凝乳酶的化学本质是蛋白质，如前所述乙醇会导致蛋白质变性， 因此随着凝乳酶添加量的增加，凝乳酶的分散度增加，乙醇诱导的凝乳酶的变性作用可能增强，导致凝胶结构变差、乳清析出增加，干酪产率降低。

由图5 可知， 随着凝乳酶添加量的增加，类Cheddar 干酪的硬度先显著增加（P < 0.05）后基本不变（P > 0.05）。 如前所述，乙醇诱导的凝乳酶变性作用的增强造成乳清析出增加， 蛋白质交联增强，引起干酪的硬度增加。

表4 凝乳酶添加量对添加酿酒酵母的类Cheddar 干酪产率的影响Table 4 Effect of rennet addition amount on yield of Cheddar -like cheese with Saccharomyces cerevisiae

图5 凝乳酶添加量对添加酿酒酵母的类Cheddar 干酪硬度的影响Fig. 5 Effect of rennet addition amount on hardness of Cheddar -like cheese with Saccharomyces cerevisiae

由图6 可知， 凝乳酶添加量对类Cheddar 干酪的口感和外观影响显著， 对气味和滋味无显著影响。 口感方面，添加223.5 IMCU/L 凝乳酶加工的干酪口感细腻，得分最高；添加894 IMCU/L 凝乳酶加工的干酪口感粗糙，颗粒感强；添加447 IMCU/L 和670.5 IMCU/L 凝乳酶加工的干酪口感较为细腻。 外观方面，添加223.5 IMCU/L 凝乳酶加工的干酪状态松散、 内部孔洞较多、 略有乳清析出； 添加894 IMCU/L 凝乳酶加工的干酪表现出色泽较暗、 稍有结皮等不良现象； 添加447 IMCU/L 凝乳酶加工的干酪色泽均一、光滑、质地紧实富有弹性，得分最高； 添加670.5 IMCU/L 凝乳酶加工的干酪表面光滑，色泽较均一。 综合评定447 IMCU/L 凝乳酶添加量加工的干酪感官评分最高。

图6 凝乳酶添加量对添加酿酒酵母的类Cheddar 干酪感官评定的影响Fig. 6 Effect of rennet addition amount on sensory evaluation of Cheddar-like cheese with Saccharomyces cerevisiae

由以上实验可知， 添加447 IMCU/L 凝乳酶加工的类Cheddar 干酪产率较高，组织较为紧实、富有弹性。

2.2 正交实验

2.2.1 工艺优化正交实验结果 以蔗糖添加量、发酵剂添加量、凝乳酶添加量为因素，依据单因素实验筛选出的最佳水平区间对类Cheddar 干酪进行三因素三水平正交实验工艺优化，结果见表5。 pH 值是反映干酪品质的重要指标之一， 影响干酪风味、控制酶活和矿质元素的平衡[23]；蛋白质和脂肪是干酪中主要干物质， 是衡量干酪营养价值的关键指标，蛋白质和脂肪回收率是考察工艺是否合理的重要指标[7，24]。 由表5 可知，4 号干酪感官评分最高，干酪产率、pH 值、蛋白质回收率、脂肪回收率较高。

2.2.2 极差分析 对正交实验的感官评定结果进行极差分析。 由表6 可以看出，蔗糖添加量、发酵剂添加量和凝乳酶添加量的R 值均大于空列的R 值，说明3 个因素对感官得分的影响均显著，影响大小依次为蔗糖添加量> 发酵剂添加量> 凝乳酶添加量。 优化得到类Cheddar 干酪的最优工艺为A2B1C1，即蔗糖添加量50 g/L， 干酪发酵剂添加量0.02 g/L，凝乳酶添加量223.5 IMCU/L。

表5 添加酿酒酵母的类Cheddar 干酪工艺条件优化正交实验结果Table 5 Result of orthogonal experiments for processing conditions optimization of Cheddar -like cheese with Saccharomyces cerevisiae

表6 添加酿酒酵母的类Cheddar 干酪工艺条件优化正交实验感官得分的极差分析Table 6 Range analysis of sensory score of orthogonal experiments for processing conditions optimization of Cheddar -like cheese with Saccharomyces cerevisiae

2.2.3 验证实验 由表7 可知，A2B1C1工艺加工的干酪感官得分高于A2B1C2工艺加工的干酪，证实通过正交实验优化的工艺加工的干酪具有最高的感官得分。

因此，以感官评分为主要评价指标，添加酿酒酵母的类Cheddar 干酪的最优工艺为A2B1C1， 即蔗糖添加量50 g/L，干酪发酵剂添加量0.02 g/L，凝乳酶添加量223.5 IMCU/L。

表7 正交实验中最优工艺加工的干酪与感官得分最高的干酪的感官评定结果Table 7 Results of sensory evaluation of the cheese processed with the optimal conditions obtained in orthogonal experiment and the cheese with the highest sensory score

3 结 语

本研究对添加酿酒酵母的类Cheddar 干酪的加工工艺进行优化。 以感官评定和干酪产率为主要测定指标，通过单因素实验确定了蔗糖的最适质量浓度为50 g/L， 干酪发酵剂的最适质量浓度为0.04 g/L，凝乳酶的最适活力浓度为447 IMCU/L；进一步通过三因素三水平正交实验和验证实验，确定添加酿酒酵母的类Cheddar 干酪的最佳工艺条件是A2B1C1，即蔗糖质量浓度50 g/L， 干酪发酵剂质量浓度0.02 g/L，凝乳酶活力浓度223.5 IMCU/L。 在此优化条件下，成品干酪色泽明亮，组织状态结实，奶香味与酒香味浓郁且适宜，接下来将会进一步研究添加酿酒酵母的类Cheddar 干酪成熟过程中的品质变化。