槲皮素通过AKT/FOXO3信号通路保护糖尿病大鼠心肌细胞

张煜敏， 张桢烨， 钱玲玲， 王宁， 缪凌峰， 王如兴

(南京医科大学附属无锡人民医院心内科， 江苏 无锡 214023)

糖尿病是人类健康的主要威胁之一，国际糖尿病联合会的数据显示，每11个成年人(20～79周岁)中就有1人罹患糖尿病。2019年国际糖尿病联盟公布全球糖尿病患者为4.63亿，我国高达1.16亿，居世界第一[1]。糖尿病心脏病变是糖尿病晚期的主要致死原因之一[2]，其病理表现主要为心肌细胞凋亡、肥厚和心肌间质纤维化并最终导致心力衰竭，其中心肌细胞凋亡是其主要病理改变之一[3]。因此，寻找有效的药物缓解糖尿病心肌细胞凋亡，有助于改善糖尿病患者的预后，延缓糖尿病患者的心血管并发症发生，降低糖尿病患者的死亡率。

槲皮素是人体日常摄入最多的一种黄酮类化合物，普遍存在于苹果、茶叶、洋葱、蓝莓等人类日常膳食之中[4]，具有抗炎症、抗肿瘤、抗衰老、抗氧化、改善糖尿病、舒张血管等多种生物学效应。槲皮素可能是改善糖尿病及其心血管并发症的潜在药物[5]，但其发挥作用的具体机制尚不完全清楚。

蛋白激酶B(AKT)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它能够使叉头核蛋白O3(FOXO3)蛋白在T32位置磷酸化而使FOXO3输出增加，从而抑制其转录功能[6]。在糖尿病情况下，AKT的活性被抑制，从而加重了FOXO3相关的细胞凋亡[7]。槲皮素不仅能够减少糖尿病时的氧化应激损伤，并且能够通过磷酸化上调AKT的活性[8]，从而抑制糖尿病时的心肌细胞凋亡。本研究主要探讨不同浓度的槲皮素通过激活AKT从而抑制FOXO3对糖尿病大鼠心肌细胞凋亡的影响及其机制，为糖尿病心脏病的防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

Mini-PROTEAN Tetra垂直电泳槽(美国Bio-Rad公司)；PCR扩增仪、Minispin高速离心机(德国Eppendorf公司)；7500HT 荧光定量 PCR 仪(美国 ABI 公司)；Allegra 46R型高速低温离心机(美国Beckman Coulter公司)；共聚焦显微镜(德国Leica公司)；Nanodrop、BCA蛋白定量试剂盒(美国Thermo公司)。 pAKT，AKT，pFOXO3，FOXO3，BAX，BCL-2，GAPDH抗体均为Cell Signaling Technology公司产品；山羊抗兔(中杉金桥公司)；槲皮素、链脲佐菌素(STZ)、DMSO、DAPI染液(美国Sigma公司)；TBST(康为世纪公司)；原位细胞死亡检测试剂盒(美国Roche公司)；Quantinova SYBR Green PCR 试剂盒(德国Qiagen公司)；PVDF膜(美国Millipore公司)；2%异氟醚(瑞沃德公司)。

1.2 实验动物

雄性SD大鼠来源于常州卡文斯实验动物有限公司，体重(180±10)g，于清洁级别环境下饲养，给予12 h交替明暗周期，充足的饲料与水。

1.3 糖尿病大鼠及槲皮素干预模型的建立与分组

参照本课题组以往研究报道的造模方法建立1型糖尿病大鼠模型[9]，将40只SD大鼠随机分为4组，每组各10只，即对照组、糖尿病组、槲皮素低剂量(50 mg/kg)干预组和槲皮素高剂量(100 mg/kg)干预组。糖尿病模型大鼠腹腔注射STZ 60 mg/kg，1周后尾静脉采血测血糖，血糖大于16.7 mmol/L判定为糖尿病成模。糖尿病大鼠成模后，每日配置槲皮素溶解于DMSO中，50和100 mg/kg灌胃给药，1个月后2%异氟醚麻醉测定各项生理数值后取心肌组织标本。

1.4 大鼠心功能测定

槲皮素灌胃1个月后，每组随机取大鼠5只，用2%异氟醚麻醉后，应用飞利浦IE33心脏彩超仪在乳头肌水平测定心功能指标： 左心室射血分数(LVEF)、左心室短轴缩短率(FS)、左心室内径(LVID)、左心室收缩末期容积(LVESV)。

1.5 TUNEL染色法检测大鼠心肌凋亡水平

大鼠心脏先经4%多聚甲醛溶液固定，脱水后包埋，切成5 μm的组织切片。将心肌组织切片用4%多聚甲醛室温固定20 min，PBS清洗3遍，加入通透液通透10 min，PBS清洗3遍，加入TUNEL反应混合物室温避光孵育1 h，PBS清洗3遍，滴上DAPI染液，共聚焦显微镜观察大鼠心肌组织细胞凋亡水平。

1.6 实时荧光定量PCR检测大鼠心肌组织Bax和Bcl-2 mRNA表达

提取心肌组织RNA，测定RNA浓度，经逆转录为cDNA，用实时定量PCR试剂盒进行扩增，扩增条件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。设计引物如下，β-肌动蛋白上游：5′-AGATTACTGCCCTGGCTCCTAG-3′，下游：5′-CCTGCTTGCTGATCCACATCT-3′;Bax上游：5′-GAACCATCATGGGCTGGACA-3′，下游：5′-GTGAGTGAGGCAGTGAGGAC-3′;Bcl-2上游：5′-GAACTGGGGGAGATTGTGG-3′，下游：5′-CATCCCAGCCTCCGTTATCC-3′。

1.7 蛋白质印迹检测大鼠心肌组织BAX、BCL-2、pAKT、AKT、pFOXO3和FOXO3蛋白表达

提取心肌组织蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白浓度，以每孔35 μg总蛋白量上样，行10%SDS-PAGE，浓缩胶70 V 40 min，分离胶100 V 60 min，100 V 100 min转膜至PVDF膜上，5%牛奶封闭2 h，TBST缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，0.05% Tween-20，pH 值 7.5)清洗3遍，一抗1 ∶1 000孵育过夜。次日，TBST清洗3遍，二抗1 ∶3 000孵育1 h，TBST清洗3遍后，ECL显色系统发光显色，并用Image J软件(德国 Rawak Software公司)进行灰度值测定。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 建模后大鼠的基本情况

槲皮素灌胃1个月后糖尿病组大鼠体重明显低于对照组(t=12.14，P<0.05)，槲皮素低剂量干预组与糖尿病组体重差异无统计学意义(t=2.30,P>0.05)，槲皮素高剂量干预组的体重明显高于糖尿病组(t=4.88，P<0.05)；糖尿病组的心脏重量明显低于对照组(t=7.805，P<0.05)，其余各组无统计学意义。见表1。

2.2 槲皮素对糖尿病大鼠心功能的影响

槲皮素灌胃1个月后，糖尿病组LVEF及FS均明显低于对照组(t值分别为12.56和11.62，P<0.05), 槲皮素低剂量干预组和高剂量干预组的LVEF均明显高于糖尿病组(t值分别为4.70和8.36，P<0.05)，槲皮素低剂量干预组和高剂量干预组的FS均明显高于糖尿病组(t值分别为3.63和6.70，P<0.05)。糖尿病组的LVID明显高于对照组(t=3.31，P<0.05)。糖尿病组的LVESV明显高于对照组(t=3.54，P<0.05)，槲皮素高剂量干预组比糖尿病组明显降低(t=5.77，P<0.05)。见表1。

2.3 槲皮素干预后糖尿病大鼠心肌细胞的凋亡水平

TUNEL染色结果显示，糖尿病组大鼠心肌组织细胞凋亡率高于对照组(t=11.20，P<0.05)，槲皮素低剂量干预组与槲皮素高剂量干预组凋亡率均明显低于糖尿病组(t分别为5.88和8.96，P均<0.05)，槲皮素低剂量干预组和高剂量干预组间凋亡率差异无统计学意义。见图1。

2.4 槲皮素干预后糖尿病大鼠心肌组织Bax、Bcl-2 mRNA和蛋白表达

糖尿病组的BaxmRNA及蛋白表达明显高于对照组(t值分别为 7.71和7.24，P<0.05)，槲皮素干预后较糖尿病组明显降低(P均<0.05)；糖尿病组的Bcl-2 mRNA及蛋白表达明显低于对照组(t值为10.65和11.73，P<0.05)，槲皮素干预后较糖尿病组明显升高(P均<0.05)。见图2。

A：大鼠心肌组织Bax和Bcl-2 mRNA表达；B、C：各组大鼠心肌组织BAX、BCL-2蛋白表达；*：P<0.05，与对照组相比；#：P<0.05，与糖尿病组相比图2 槲皮素对糖尿病大鼠心肌组织Bax、Bcl-2mRNA及蛋白表达的影响(n=4)

2.5 槲皮素干预后糖尿病大鼠心肌AKT、FOXO3蛋白及磷酸化水平

糖尿病组的pAKT的表达明显低于对照组(t=9.19，P<0.05)，槲皮素低剂量干预组与高剂量干预组的 pAKT的表达明显高于糖尿病组(t值分别为3.25和4.17，P均<0.05); AKT表达在4组之间无明显差异；糖尿病组的pFOXO3表达明显低于对照组(t=7.71，P<0.05)，槲皮素低剂量干预组和高剂量干预组的pFOXO3表达明显高于糖尿病组(t值分别为3.60和3.50，P<0.05)。见图3。

3 讨论

研究表明，多种机制参与了糖尿病时心脏收缩及舒张功能的变化，其中包括心肌能量代谢、心脏结构和功能异常等机制[10]。本研究首先建立STZ诱导的1型糖尿病大鼠模型，期间不仅观察到糖尿病特征性的多饮多食和体重减轻，而且观察到明显的心功能改变包括舒张和收缩功能的下降，提示糖尿病时大鼠心功能受损。糖尿病时的心肌细胞病理改变是糖尿病心脏病变的主要特征，它促成了心衰时心功能的持续性下降[11]。在心肌梗死、缺血再灌注和糖尿病心肌病等病理状态下都可以观察到心肌细胞凋亡[12-13]。糖尿病时血糖升高，氧化应激增多，心肌细胞也发生了诸多病理改变[14]。本研究TUNEL染色结果表明糖尿病时期心肌细胞凋亡明显增多。

多项实验结果显示，槲皮素能够缓解糖尿病及其并发症[15-16]。本实验中槲皮素灌胃给药后糖尿病大鼠的心功能有所改善，心肌细胞的凋亡减少，但槲皮素对心肌细胞保护作用的剂量依赖性不显著。进一步分析结果显示糖尿病时BAX蛋白表达明显增高，在喂养槲皮素之后BAX蛋白表达水平明显下降；而另一凋亡抑制蛋白BCL-2在糖尿病时明显下降，槲皮素干预后表达明显上升。结果提示槲皮素有对抗糖尿病时心肌细胞凋亡的作用。实时定量PCR结果显示，Bax与Bcl-2的mRNA表达变化与蛋白一致。这证明了槲皮素能够在基因水平上改善心肌细胞的凋亡。这一潜在机制可能与AKT/FOXO3信号通路有关，AKT是调控细胞增殖、分化及凋亡中的重要一环，而FOXO3作为AKT的下游，与细胞的凋亡密切相关[17]。本研究观察到pAKT蛋白的表达在糖尿病时期有所下降，槲皮素干预后pAKT蛋白的表达明显上升。而FOXO3在槲皮素干预之后也明显改善，提示槲皮素对糖尿病大鼠心肌细胞凋亡的保护作用可能与上调AKT/FOXO3通路有关。

综上，本研究结果表明槲皮素通过激活AKT/FOXO3信号通路减少糖尿病心肌细胞凋亡，从而保护糖尿病心肌细胞，改善心功能。槲皮素可能是治疗糖尿病心脏病变的新型潜在药物。