基于网络药理学和分子对接探讨凉血消斑汤治疗寻常型银屑病的作用机制

汤菲菲， 梁鹏晨， 石涵芬， 张泽涵， 孟庆鸿，程发峰， 王庆国， 王雪茜

(1. 北京中医药大学中医学院， 北京 100029； 2. 上海中医药大学研究生院， 上海 201203)

银屑病是T细胞介导的慢性炎症性皮肤病, 典型特征是表皮增生、角化过度、炎性细胞浸润及新生血管形成[1-2]，其病理主要包括角质形成细胞增殖和分化异常，角质层Munro微脓疡形成以及真皮浅层以淋巴细胞为主的炎症细胞浸润[3]。银屑病的全球患病率为0.1%～3.0%[4]，根据一项中国六省市调研结果显示，我国银屑病患病率达0.6%，且临床分型以寻常型银屑病为主(97.06%)[5]。银屑病由多个基因控制，并且还受到诸如遗传、感染、代谢和免疫功能障碍等因素的影响[6-7]。

凉血消斑汤是王庆国教授治疗银屑病血热证的代表方，以白虎汤合清营汤为基础加减而成，由生石膏、知母、水牛角丝、连翘、生地、赤芍和忍冬藤等药味组成。全方以大剂量石膏为君，联合凉血清气之品，发挥“透热转气”之功，“透热转气”法也是临床上治疗银屑病血热证的思路之一。但复方存在复杂的物质基础和多靶点、多途径的效应模式，为系统研究凉血消斑汤对银屑病的作用机制，本研究通过网络药理学方法来挖掘复方的作用靶点与通路，在此基础上利用核心分子-蛋白对的分子对接来进一步验证。

1 材料与方法

1.1 药物潜在靶标与疾病基因获取

在TCMSP(http:∥www.tcmspw.com/tcmsp.php)平台检索知母、赤芍及连翘的化学成分，以口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%和类药性(drug-likeness, DL)≥0.18作为筛选标准得到这三味药的有效成分，同时在此数据库获得所有有效成分的作用靶点。通过BATMAN-TCM(http:∥bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)得到生石膏、生地黄、水牛角和忍冬藤的有效成分及对应的作用靶点(分数阈值≥20)。

以“psoriasis”作为关键词，从GeneCards数据库中得到银屑病相关基因。

1.2 交集基因与核心基因筛选

运用R语言将该方药物成分的预测靶点与银屑病相关靶点进行映射，得到凉血消斑汤与银屑病的交集靶点。将得到的交集靶点上传到STRING(https:∥string-db.org/)，根据交集基因之间的相互作用计算每个基因的结点评分，再将评分数据输入到Cytoscape 3.7.2软件中，利用Cytohubba插件和马修斯相关系数(MCC)算法筛选出结点评分≥2倍中位数的基因，即核心基因。

1.3 PPI与药物-成分-靶点-疾病网络构建

将筛选所得核心基因导入STRING数据库，蛋白质类型定义为“Homo sapiens”，设定置信度得分≥0.4，去除游离蛋白，得到蛋白的相互作用关系后导入Cytoscape 3.7.2软件，分别构建核心基因之间的蛋白互作网络(PPI)以及药物-成分-靶点-疾病网络模型[8]。运用R语言基于蛋白间相互作用度值绘制排名前30的基因靶点条形图。

1.4 通路富集分析

将筛选的核心交集靶点导入Metascape平台(http:∥metascape.org)，该平台提供的富集分析包括KEGG、GO、R-HAS(生物学反应及信号通路)、Canonical Pathways(经典通路)、hall标记基因集等，将所有具有统计学意义的富集项通过累积超几何P值和富集因子进行筛选过滤，根据基因间的κ统计相似性将剩余的富集项分层聚类，以κ值=0.3作为阈值，将分层聚类树转化为富集项集群。以集群中具有代表性的富集项作为该群集的子集，并通过Cytoscape 3.7.2构建可视化子集网络。

通过MCODE算法对PPI网络进行蛋白质紧密度识别和模块划分。通过富集分析，罗列出每个模块P值排名前3位的富集项。

1.5 分子对接

通过PubChem(https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获取化合物的MOL2文件，用Open Babel 2.3.2软件将MOL2文件转化为PDB文件，从Protein Data Bank (http:∥www.rcsb.org/pdb) 数据库中检索获得相应的受体蛋白，利用PyMol 2.3.4和AutoDockTools软件对受体蛋白进行系列操作与修饰，利用AutoDock Vina 1.1.2对5个受体蛋白与9个配体分子两两进行分子对接，所得结合能越低则提示受体与配体的结合效果越好。本研究假设结合能<-8 kcal/mol为结合具有显著性，以此验证凉血消斑汤在银屑病治疗中的合理性。利用Ligplus软件分析化合物与蛋白对接的疏水和氢健作用力。

2 结果

2.1 药物-疾病交集基因与核心基因筛选结果

根据筛选原则，从TCMSP和BATMAN数据库中获得凉血消斑汤的有效成分共121个，可预测到932个对应的非重复靶标。在GeneCards数据库中检索“psoriasis”，共发现3 766个与银屑病相关的基因。通过韦恩图的绘制发现，药物潜在靶标与疾病基因之间共有270个交集基因。将这270个交集基因在STRING数据库中的信息导入Cytoscape 3.7.2软件，通过cytohubba插件计算每个基因的MCC得分，求得其中位数为120 444 286，根据“≥2倍中位数”的筛选原则，精选得到128个核心基因。

2.2 PPI与凉血消斑汤-化合物-靶点-银屑病网络构建结果

将128个核心基因导入STRING数据库得到PPI网络及根据节点的度值绘制的条形图(图1)，网络图由128个节点和3 370条边构成，在PPI网络的蛋白中，度值排名前10的分别为胰岛素(INS)、蛋白激酶1(AKT1)、白介素6(IL-6)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、Myc原癌基因蛋白(MYC)、表皮生长因子受体(EGFR)、JUN蛋白(JUN)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、半胱氨酸蛋白酶3(CASP3)、前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)。

图1 蛋白互作网络图与其条形图

使用Cytoscape 3.7.2软件构建凉血消斑汤-化合物-靶点-银屑病网络(图2)。图中共有190个节点，613条线。红色和深蓝色标识分别代表疾病和中药复方，绿色和浅蓝色分别代表疾病的基因靶标和复方的有效成分，连线反映有效成分效应的靶标。

图2 凉血消斑汤-化合物-靶点-银屑病网络

2.3 Metascape平台分析结果

利用Metascape平台对128个交集靶点进行处理，得到本体集群富集结果，根据P值从小到大排列，取P值最小的前20项列举如下(图3)。凉血消斑汤在干预银屑病的过程中主要涉及的生物学功能包括：对脂多糖的反应、对毒物的反应、凋亡信号通路、对无机物的反应、对伤口的反应、对肽的反应、对胞外刺激的反应、血管发育、细胞黏附调节、细胞死亡的积极调控、对生长因子的反应及活性氧代谢过程等，主要涉及的通路包括：白介素信号、癌症通路、糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、PI3K-Akt信号通路、AP1通路和ATF2通路等，与银屑病密切相关的生物学功能与通路主要有凋亡信号通路、血管发育、细胞黏附调节、细胞死亡的积极调控以及白介素、IL-17、PI3K-Akt等信号通路等。

图3 本体集群富集条形图

进一步得到子集网络，每个圆形节点代表一个富集项，不同颜色代表不同的子集，圆形大小与每个子集所含基因数成正比，κ相似性>0.3的富集项之间由边相连，且连线的粗细与κ值成正比。通过“力导向”的布局模式使每个子集更加聚集。子集标签是从每个集群中选择的一个富集项的名称。用颜色的深浅来表达每个富集项的P值，颜色越深P值越小，见图4。

不同颜色代表不同模块，颜色的深浅代表不同P值图4 本体集群富集网络

将MCODE算法运用到PPI网络中，识别蛋白紧密相关的邻域，每个颜色代表1个MCODE网络，同一模块的蛋白联系更为紧密，共得到6个MCODE网络(图5)，MCODE1和MCODE2与艾滋病、乙型肝炎、神经酰胺通路和癌症通路相关，MCODE3与癌症、内分泌相关，MCODE4与细胞凋亡有关，MCODE5与肽基酪氨酸磷酸化调控、癌症中的蛋白聚糖有关，MCODE6与肽配体结合受体、G蛋白偶联受体信号通路有关。每个模块单独罗列(图6)。每个网络进行富集分析，P值排名前3位的富集项被保留(表1)。

图5 PPI网络

图6 PPI网络模块组成

表1 富集项列表

2.4 分子对接结果

根据蛋白互作结果度值排名前10的靶点，再筛选出靶点数、对应成分数最多的成分和靶点，由此得到凉血消斑汤治疗银屑病可能的关键成分与靶标：薯蓣皂苷元(Diosgenin)、己醛(Hexanal)、山柰酚(Kaempferol)、木犀草素(Luteolin)、槲皮素(Quercetin)、汉黄芩素(Wogonin)、黄芩素(Baicalein)、油酸(Oleic acid)、水杨酸(Salicylic acid)等9个成分以及AKT1、IL-6、JUN、PTGS2、VEGFA等5个靶标。分别得到两两间的分子对接结合自由能(表2)，发现AKT1-Diosgenin、PTGS2-Diosgenin、PTGS2-Kaempferol、PTGS2-Luteolin、PTGS2-Quercetin的结合能均<-9 kcal/mol，而IL-6-Diosgenin、AKT1-Kaempferol、AKT1-Luteolin、AKT1-Quercetin、AKT1- Wogonin、AKT1-Baicalein的结合能均<-8 kcal/mol。最后构建出AKT1-Diosgenin、PTGS2-Diosgenin、PTGS2-Kaempferol、PTGS2-Luteolin、PTGS2-Quercetin的分子对接模式(图7)。

表2 化合物与蛋白靶标的结合能 kcal/mol

其中Diosgenin与AKT1蛋白对接中，该化合物与周围蛋白残基主要是疏水作用。Baicalein与PTGE2蛋白的对接中，该化合物与周围蛋白残基也主要是疏水作用。Luteolin与PTGE2蛋白的对接中，该化合物与周围蛋白残基的Ile408、Gln406、Gln405氨基酸成氢键作用，与Leu283等成疏水作用。

A： AKT1与薯蓣皂苷元； B： PTGS2与黄芩素； C： PTGS2与薯蓣皂苷元； D： PTGS2与山柰酚； E： PTGS2与木犀草素； F： PTGS2与槲皮素图7 凉血消斑汤核心成分与PTGS2和AKT1的分子对接模式

3 讨论

在寻常型银屑病中医证素诊断量化研究中，血热证占主导地位，且与血分息息相关[9-10]。银屑病急性期表现具有明显血热证特征：皮疹色红，发展迅速，鳞屑多，点状出血明显，伴瘙痒，常伴咽痛、口渴、便干、溲赤、易怒、舌红绛、苔薄黄和脉弦滑等。急性发病期的银屑病患者呈现进行性发展的炎性丘疹、基底浸润明显及明显的出血现象[11]。因此，清热凉血法成为银屑病重要的治疗思路之一。本研究所选凉血消斑汤以清气法为主，佐以凉血，在凉血的基础上清热透热于外，清血热以透外疹。但凉血消斑汤治疗银屑病的机制尚不清楚，阻碍了该方的进一步开发与应用，本研究通过网络药理学与分子对接结合的模式对其可能机制进行初步探讨与验证。

在该项研究中，通过PPI网络获得凉血消斑汤治疗银屑病的核心靶标，如INS、AKT1、IL-6、VEGFA、MYC、EGFR、JUN、MAPK、CASP3、PTGS2等。其中大多数靶标已被证实在银屑病的各种病理改变中起重要作用，如IL-6、PTGS2参与异常的炎症因子分泌与炎症细胞诱导[12-14]，VEGF是目前所知最重要的生理和病理状态下血管新生的调节因素[15-16]，AKT、MAPK、CASP3、JUN的细胞自噬与细胞凋亡相关功能与成纤维细胞的过度增殖有关[17-18]。许多研究证实银屑病的发生可能与胰岛素抵抗有密切联系[19-20]。在得到PPI核心靶标的基础上，结合调控靶点数和对应化合物数目排序在前的有效成分和靶点，筛选出9个成分与6个靶标，两两进行分子对接，结果显示，AKT1-薯蓣皂苷元、PTGS2-薯蓣皂苷元、PTGS2-山柰酚、PTGS2-木犀草素、PTGS2-槲皮素之间表现出理想的结合能力，凉血消斑汤可能是通过薯蓣皂苷元、山柰酚、木犀草素及槲皮素等有效成分，干预AKT1及PTGS2等靶标，从而影响下游通路，继而改善银屑病。富集分析结果表明，银屑病中的白细胞介素信号、AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、PI3K-Akt信号通路可能是该方治疗银屑病发挥主要功能的途径。另外，凉血消斑汤还可通过调节细胞凋亡与死亡、血管发育和细胞黏附等生物学功能来干预银屑病。血管新生是银屑病的重要病理环节，VEGF是目前所知最重要的生理和病理状态下血管新生的调节因素，银屑病患者皮损区VEGF水平较非皮损区及正常皮肤明显增高[21-22]。银屑病的发病与角质形成细胞的凋亡情况密切相关，但是凋亡的促进或抵抗在银屑病中仍没有统一结论[23]。另外，银屑病患者的微脉管系统经历形态学改变后，淋巴细胞通过黏附分子黏附到内皮细胞，穿过内皮完成淋巴细胞迁移，细胞黏附的发生是皮损中炎性细胞聚集的重要因素[23]。

根据基因表达谱，在银屑病患者皮肤中，PGE2信号通路和IL-23/Th17通路呈正相关。IL-23是Th17细胞产生和维持IL-17所必需的，其诱导Th17细胞的PTGS2编码COX2，产生PGE2，PGE2作用于这些细胞的PGE受体,从而放大其上游的IL-23信号，PGE2同时也可诱导多种炎症相关基因的表达[25-26]。结合通路富集与分子对接结果，将IL-17与PI3K-Akt作为凉血消斑汤可能发挥作用的两条重要信号通路。银屑病的发生及病情严重程度与IL-23/Th17/IL-17轴相关细胞因子的高表达有关[27-28]。自噬在银屑病等自身免疫疾病中主要起四个作用，即去除胞内病原体，淋巴细胞发育，促炎信号传导和分泌途径[29-30]。激活PI3K/AKT抑制自噬被认为是治疗IL-17A介导的银屑病的一种治疗方法[31]，而IL-23通过活化AKT/mTOR信号通路抑制细胞自噬活性[32]。凉血消斑汤可能通过炎症和自噬两个方面治疗和缓解银屑病。

在筛选出的凉血消斑汤重要有效成分中，薯蓣皂苷元已被证实抑制HaCaT角质形成细胞的生长，下调促炎因子，并抑制血管形成，减轻咪喹莫特诱导的小鼠银屑病模型[33]。山柰酚可减少银屑病皮损中包括IL-17A在内的主要促炎因子，并可降低银屑病样小鼠的脾脏和淋巴结中的IL-17A+CD4+T细胞百分比[34]。木犀草素能减轻银屑病皮肤病变，抑制巨噬细胞、T细胞和中性粒细胞在表皮的浸润，并降低皮损中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-23和IL-17A等细胞因子的表达[35]。槲皮素可通过NF-κB通路在咪喹莫特诱导的小鼠中发挥抗银屑病作用，其潜在机制可能是抗氧化剂和抗炎状态的改善以及对NF-κB信号传导的抑制[36]。现代药理学研究证明，黄芩素具有抗炎及免疫调节功能，在甲型流感中能降低TNF-α、IL-6水平来调节炎症反应[37]。但关于这些单体与AKT1、PTGS2及IL-17通路、PI3K-Akt通路的相关实验研究较少，有待进一步探索。

综上，凉血消斑汤治疗血热型银屑病可能是通过PTGS2、AKT1等靶标对IL-23/Th17轴相关因子水平的调节及机体自噬水平的干扰来实现的。目前通过网络药理学和分子对接的研究，仍然无法确定凉血消斑汤对这些途径的抑制或者激活作用。可以通过部分活性成分的前期实验结果推断凉血消斑汤可能通过抑制或激活白细胞介素信号、AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、PI3K-Akt信号通路来达到治疗作用。通路的具体调控过程有待后续实验研究进一步验证。