急性酶解血管平滑肌及Genistein 对其泡沫化的影响

卢楠娟，白 冰，何 箫，张黎明

心血管病是全球发病率和病死率的主要原因，动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是大多数心血管病发病的基础[1-4]。 泡沫细胞形成在AS 发生、发展的各环节都发挥着重要的作用，然而目前尚没有效逆转AS 的方法[5]。 Allahverdian 等[6]报道发现平滑肌细胞在人类冠状动脉粥样硬化斑块中比之前已知的要多， 人类AS 斑块中许多被鉴定为单核细胞源性的泡沫细胞实际来源于平滑肌细胞。 血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMC） 是构成人类AS 斑块中的主要类型细胞[7-8],需进一步研究平滑肌源性泡沫细胞生物发生的特异性机制，以探索其在AS 中的作用。

Genistein 是异黄酮类化合物，主要在豆类植物中，可调整血脂、抗氧化、抑制血管炎症等反应，也是天然的酪氨酸激酶 （protein tyrosine kinase，PTK）抑制剂，从而具有直接或间接抗AS 作用[9-11]。 因此，本研究探讨Genistein 对平滑肌源性泡沫化的影响,为抗AS 治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 8~12 周龄健康雄性维斯塔尔（Wistar）大鼠，来自哈尔滨医科大学第二附属医院实验动物中心提供，Dulbecco 改良的Eagle 培养基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）高糖型；胎牛血清购自ExCellBio 公司； 氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)购自广东奕源生物公司；平滑肌肌动蛋（α-smooth muscle actin，SMA） 抗体购自 Abcam 公司；FITC 标记的山羊抗兔抗体购自美国AffinitY 公司；木瓜蛋白酶、二硫代苏糖醇 （DL-Dithiothreitol，DTT）、 氯 化 钙 （Calcium chloride，CaCl2）、4- 轻乙基呱嗦乙磺酸（2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid，HEPES）、油红 O 染料、 葡萄糖（glucose,Glu）、Genistein、Daidzein、Tyrphostin等试剂购自Sigma 公司。

1.2 仪器和设备 体式显微镜购自日本Nikon SMZ645； 荧光显微镜、 倒置相差显微镜购自日本Olympus 公司；细胞培养箱美国Thermo 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 肠系膜动脉平滑肌细胞（mesenteric artery smooth muscle cells，MASMC）原代分离、培养 Wistar大鼠颈椎脱臼;放血；75%酒精消毒，打开腹腔，结扎肠系膜动脉主干；体式显微镜下去除肠系膜动周围脂肪组织。 取0 ℃无钙生理盐溶液[12]（physiological salt solution,PSS）漂洗和冲洗血管腔内残留的血液。去除肠系膜动脉主干及末端细小分支，保留肠系膜动脉2、3 级分支。 用高压灭菌的1%双抗PSS 漂洗血管段，移入 1 ml 分离液(9.7 ml PSS、0.3 ml 50 mg/L牛血清白蛋白和1 μl 1 mol/L CaCl2)内，眼科剪把肠系膜动脉剪成约1 mm×1 mm 的小段。 加入1.5 mg DTT，于37 ℃水浴摇床内预热10 min。 加入1.5 mg/ml木瓜蛋白酶溶液，37 ℃水浴摇床内孵育10 min；加入含1.5 mg/ml 透明质酸酶的分离液和1 mg/ml 胶原酶F 溶液，37 ℃水浴中孵育6 min。 再次离心,弃掉上清夜，用0 ℃的分离液漂洗，终止酶反应。2 ml 10%FBS 的 DMEM 培养基， 轻轻吹散均匀， 置于 37 ℃5% CO2培养箱3.5 mm 培养皿内培养， 分别于相应时间点1 d、5 d 后取出观察细胞生长变化。 待细胞长到90%汇合度的时候，进行传代培养。

1.3.2 台盼蓝染色 急性酶消MASMC 制备单细胞悬液（106细胞/ml），细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9∶1 混合混匀。 血球计数板计数3 min 内活细胞和死细胞数，计算活细胞率。

1.3.3 实验分组和处理 实验分5 组，分组如下：对照组(细胞和高糖培养基)、模型组（50 mg/L ox-LDL）、Genistein 组（50 μmol/L Genistein 与 50 mg/L ox-LDL）、Daidzein 组(50 mg/L ox-LDL 与 50 μmol/L Daidzein)、Tyrphostin 组(50 mg/L ox-LDL 与 50 μmol/L Tyrphostin)。

1.3.4 油红O 染色 将原代平滑肌细胞以1×105/孔接种12 孔板，4 h 后待细胞贴壁加入含50 mg/L ox-LDL 的 10%FBS 的 DMEM 培养 24 h，PBS 漂洗，40 g/L 多聚甲醛固定15 min，60%异丙醇润洗，每孔加入 0.5 ml 过滤好的油红 O 染色 30 min，PBS 漂洗，倒置显微镜下观察泡沫细胞染色。

1.3.5 油红萃取实验 上述油红O 染色后， 每孔加入0.5 ml 异丙醇萃取细胞内油红O 染色液，取100 μl 加入 96 孔板，518 nm 处测其吸光值，定量检测细胞内脂质含量。

1.3.6 免疫荧光化学染色 取第3 代细胞， 每孔1×105个细胞接种于12 孔板内，细胞汇合度60%时，PBS 漂洗，4%多聚甲醛固定10 min； 磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）漂洗，0.1%TritonX-100 透膜孵育 5 min；PBS 漂洗，10%山羊血清封15 min； 兔抗鼠 α-SMA 抗体 (1∶200)4 ℃孵育过夜，PBS 漂洗，FITC 标记的山羊抗兔 IgG(H 与 L)(1∶100)避光孵育细胞 60 min；PBS 漂洗，DAPI 避光染核5 min；PBS 漂洗，抗淬灭剂封片，倒置荧光显微镜下观察培养的 MASMC 胞浆内肌动蛋白被α-SMA 标记后呈绿色荧光， 胞核被4,6- 二脒基-2- 苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染成蓝色。 随机选取4 个不同的视野， 计算α-SMA 表达阳性百分比，鉴定 VSMC 及检测α-SMA 的表达。

1.4 统计学方法 应用Graph pad prism8.0 软件作图， 对数据进行统计学分析， 实验数据以x±s 表示，多组均数比较采用单因素方差分析，两组之间比较采用t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两步法急性酶解分离并原代培养MASMC两步法急性酶解分离可得到大量同源单个MASMC,显微镜下观察MASMC 呈长梭形（图1A）。培养24 h细胞呈圆形或梭形， 贴壁良好(图1B)； 培养 5 d 后VSMC 具有典型的“峰 -谷”结构（图1C）。

2.2 细胞活力鉴定 死亡的MASMC 被台盼蓝染成蓝色，活性良好MASMC 拒染呈无色。急性酶解获取MASMC 活性达 99%以上（图2）。

2.3 MASMC 的鉴定 α-SMA 是鉴定 VSMC 的标记分子[13]。 荧光显微镜下观察到，α-SMA 表达阳性率占95%（图4），表明分离培养的是高纯度VSMC，可用于后续实验。

2.4 ox-LDL 与MASMC 共培养建立泡沫细胞模型ox-LDL（50 mg/L）诱导 MASMC 发生泡沫样变。ox-LDL 刺激24 h 后， 油红O 染色显示细胞吞噬油红脂质，细胞变圆，体积增大（图3B）,提示泡沫细胞模型建立成功。

图 1 MASMC 形态和生长特点（×100）

图 2 MASMC 台盼蓝染色（×100）

2.5 Genistein 抑制泡沫细胞的形成 油红O 染色实验显示模型组与对照组(图3A)相比吞噬大量红色脂滴(P< 0.01)，Genistein 组与模型组相比吞噬红色脂滴显著减少(P< 0.05),而Daidzein 组吞噬红色脂滴无明显变化(P> 0.05)，Tyrphostin 组吞噬红色脂滴显著减少(P< 0.05，图3)；油红萃取结果显示模型组较对照组增高 1.72 倍(P< 0.05)，Genistein 组较模型组降低了 1.18 倍(P< 0.05)，而Daidzein 组较模型组增高 1.12 倍(P＞ 0.05)，Tyrphostin 组较较模型组降低了 1.22 倍(P< 0.05)。

2.6 Genistein 促进泡沫细胞表达α-SMA 与对照组相比， 模型组 α-SMA 表达明显降低（P< 0.01）；Genistein 组与模型组相比 α-SMA 表达增多（P<0.05）,Daidzein 组与模型组相比α-SMA 表达无明显变化，Tyrphostin 组与模型组相比α-SMA 表达增多（P< 0.05，图 4）。

3 讨论

目前报道了人和鼠VSMC 原代培养方法，主要包括组织贴块法[14-16]和酶消化法[14-17]，酶分离法经过不断的改进，越来越显示其优越性。 本实验参考国内外文献中VSMC 的分离方法， 使用木瓜蛋白酶和胶原酶两步法，成功地分离出大鼠MASMC。 组织块[15-17]培养需要2~3 w，甚至更长时间，本实验采用木瓜蛋白酶和胶原酶分离MASMC 仅需1 h；组织块培养时容易混入内皮细胞和成纤维细胞获得的VSMC 纯度低是一个严重的缺点，而本研究条件下内皮细胞不易存活[18]；用免疫荧光鉴定VSMC 的特异性标志蛋白α-SMA 阳性率达95%；台盼蓝染色显示细胞活性达99%以上；一旦用酶消化分离，原代培养的血管平滑肌细胞就保持了原来的表型。 因此，本研究克服了以往组织培养方法的缺点，建立了一种周期短且可靠的分离和培养高纯度、细胞活性良好、易获取大量同源单个细胞并保持原有特性的大鼠MASMC 的方法，对后续实验研究不会产生偏差。

图3 油红O 染色(×200)和油红萃取结果(n=3)

图 4 VSMC 的 α-SMA 表达（× 200）

长期以来， 血脂异常一直被认为是AS 相关冠状动脉和外周血管疾病的独立危险因素，也是许多干预措施的靶点[19-20]。 ox-LDL 对血管壁成分的生物学效应在AS 中起着重要作用[21]。传统的观念认为泡沫细胞主要来源于巨噬细胞，而研究证实在人冠状动脉斑块中超过50%的泡沫细胞来源于VSMC[6]。因传代细胞可能发生转化，本研究采用急性酶解获取原代VSMC，更接近与人体状态。 用50 mg/L ox-LDL作用24 h 后成功诱导VSMC 源性泡沫细胞模型，油红 O 染色发现细胞吞噬大量脂滴，ox-LDL 诱导VSMC 泡沫化，细胞完整，并未发生严重凋亡坏死而影响后续实验。

Genistein 具有抗氧化、 调节血脂等抗AS 的作用[22]，Genistein 是一种 PTK 抑制剂，可以抑制平滑肌源性泡沫细胞表型的转化[23]，为了进一步研究Genistein 抗AS 的作用机制， 本研究采用Daidzein与 Genistein 比较，Daidzein 具有与 Genistein 相似的结构，但Daidzein 没有抑制PTK 的作用。 研究发现Daidzein 不影响平滑肌泡沫化，Genistein 抑制平滑肌细胞泡沫化，那么Genistein 对脂质的调节作用可能与其抑制PTK 活性有关。 为此，同时研究了另一种PTK 抑制剂Tyrphostin 对平滑肌细胞泡沫化影响。结果发现，Tyrphostin 抑制平滑肌细胞泡沫化，表明Genistein 抑制脂质的蓄积与依赖于PTK 抑制剂的生物活性相关。 内膜平滑肌细胞发生表型转换同样参与了动脉粥样硬化的发展，本实验证明ox-LDL诱导α-SMA 的表达降低，与SMCs 的收缩性表型的缺失相关。目前对Genistein 的研究还未受到学术界的重视， 本研究表明Genistein 具有良好地抑制VSMC 源性泡沫细胞形成的作用， 为进一步研究抗AS 治疗提供了理论依据。

综上所述，酶解法可获取大量同源的单个高纯度高活性VSMC，Genistein 抑制ox-LDL 诱导的平滑肌源性泡沫细胞的形成，与其抑制PTK 的生物活性作用有关，为指导临床应用提供参考。