大鼠爪印印迹分析用于骨关节炎疼痛模型评估

李学艳，张 春，陈 默，顾成永

骨关节炎(osteoarthritis, OA)是一种慢性关节退行性病变，关节疼痛是其主要临床症状，严重影响了患者的生活质量[1]。 目前，关于OA 疼痛的研究越来越多。 然而，人体试验在人类价值和科学价值之间存在一定的观念冲突，所以利用动物模型实现科学研究成为了必不可少的部分[2]。 但是，在疼痛研究中，客观准确的评估动物的疼痛学行为一直是一个难题。 采用von Frey 丝测定机械疼痛阈值被认为是经典的疼痛评估方法，但它极易受到操作者主观因素干扰，测量值不稳定[3]。 近年来CatWalk 步态分析以其便捷、实时、客观的优势进入疼痛评估的行列[4]，但其价格昂贵，并非多数实验室配备。 所以寻找一个较为简便且经济、客观的实验性疼痛衡量标准极为重要。

分析动物爪印印迹是一个简易、经济成本较低且主观因素较少的测痛方法。 自上世纪80 年代以来，有学者提出，测量并分析动物爪印印迹可以有效评估坐骨神经及跟腱功能，间接反映功能受损程度[5-6]。 OA 模型是目前研究OA 疼痛的常见模型，不同于功能性受损。 故本研究应用OA 模型大鼠爪印印迹，测量并分析足印长度(print length，PL)、足趾扩展度(toe spreading length，TS)及中间足趾距离(inter toe distance，IT)，将其与经典的 von Frey 机械痛阈相比较，评估爪印印迹在OA 模型疼痛中的作用。

1 材料与方法

1.1 动物模型建立 选取4~6 w 健康雄性SD 大鼠30 只，体重170~220 g。 本研究经由南京医科大学附属苏州医院实验动物委员会批准。 动物房温度恒定为25 ℃，通风良好，且光照与黑暗12 h 周期交替。 给予腹腔注射10 %水合氯醛(300 mg/kg)麻醉大鼠， 将其固定于手术台， 右侧膝关节周围备皮、消毒、铺巾，记为实验侧（Experiment, E）。 根据 Burston等[7]的造模方法，用1 ml 注射器沿胫骨平台上缘行关节腔注射碘乙酸钠(monosodium iodoacetate, MIA)1 mg (50 μl) ，活动大鼠膝关节，让药物充分扩散，左侧不做任何操作，记为正常侧(Normal, N)。 在造模前(第 0 d)、造模后第 7、14、21、28 d 分别测量每只大鼠正常侧和实验侧后爪机械疼痛阈值并采集爪印印迹。

1.2 von Frey 测定机械痛阈 在造模前 (第0 d)、造 模 后 第 7、14、21、28 d 时 测 定 机 械 缩 足 阈 值(mechanical withdraw threshold,MWT)。 参照 Sagar 等[8]的测量方法，将待测大鼠置于透明箱中，底部放金属网架。 行为学测试于每日固定时间进行，测试前将大鼠置于透明箱内适应约1 h，待大鼠安静，采用不同大小的 von Frey 细 丝（规格为 1，1.4，2,4,6,8,10,15,26 g），按照从小到大的顺序依次进行测试，垂直刺激大鼠足底第二三跖骨之间位置。 刺激持续时间为8 s， 大鼠出现缩足或舔足现象时记为阳性，同一大小的von Frey 细丝刺激间隔30 s， 不同大小刺激间隔5 min， 同一细丝刺激5 次出现3 次阳性时记为最小刺激强度。

1.3 大鼠爪印印迹相关参数测量及计算 制作一个长150 cm,宽10 cm 的黑暗狭窄步道，步道底部铺设同等大小白纸，终点设有光孔，以便大鼠直线向终点光亮处行走。将大鼠后爪均匀蘸取墨水（N 为蓝色，E 为红色）后，置于步道里让大鼠通过。白纸上印有大鼠后爪印迹，相机拍摄后用于统计分析。

根据Murrell 等[6]的测量方法，本研究测量了3个参数，见图 1：（1）PL 表示爪印最长距离；（2）TS 表示第一脚趾到第五脚趾的距离；（3）IT 表示第二脚趾到第四脚趾的距离。 选取每张纸上同色的3 个清晰爪印，使用Image J 软件测量各参数数值，计算足印长度因子(print length factor, PLF)、足趾扩展因子(toe spreading length factor，TSF) 和中间足趾因子(inter toe distance factor, ITF)，计算公式参照Murrell等[6]的计算公式如下：

PLF=(NPL-EPL)/NPL

TSF=(NTS-ETS)/NTS

ITF=(NIT-EIT)/NIT

图1 爪印印迹 PL、TS、IT 测量方法

1.4 统计学方法 应用SPSS 26.0 软件进行统计学分析。计量资料以x±s 表示。采用重复测量方差分析比较不同时间点实验侧 MWT、PLF、TSF、ITF 的差异性，LSD-t检验进行两两比较；配对t检验比较实验侧与正常侧von Frey 机械缩足阈值的差异性；采用Pearson相关系数法进行相关性分析， 以相关系数r表示两样本间的相关性。P< 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 von Frey 机械缩足阈值 造模第0 d 时， 大鼠双侧后爪von Frey 细丝测量的最大反应值均为26 g，双侧 MWT 均为(21.97±5.39)g，两者无显著差异。 实验侧MWT 随造模天数逐渐减小，在第28 d 时为最小值(6.07±1.44)g，造模后第 7、14、21、28 d 的 MWT相比第0 d 时差异显著(P< 0.05)。而正常侧的MWT在造模各时间点比较均无统计学差异(P> 0.05)。 实验侧与正常侧间 MWT 在造模后第 7、14、21、28 d比较有显著差异(P< 0.05)。 见表1 和图2。

表1 大鼠OA 模型正常侧与实验侧后爪MWT比较()

表1 大鼠OA 模型正常侧与实验侧后爪MWT比较()

注: 与正常侧同一时间比较,①P < 0.05;与同组内造模前(第0 d)比较,②P < 0.05

造模时间(d) 正常侧(g) 实验侧(g)0 21.97±5.39 21.97±5.39 7 21.24±5.54 14 23.06±4.96 11.82±2.65 21 21.22±5.53 8.26±1.55 28 22.71±5.12 6.07±1.44

图2 大鼠OA 模型正常侧与实验侧后爪MWT 折线图

2.2 大鼠爪印印迹相关因子 建立大鼠OA 模型后，随着造模天数增加，大鼠通过黑暗步道时爪印的 PLF、TSF、ITF 也随之增加。 造模后第 7、14、21、28 d 的 PLF、TSF、ITF 相比第 0 d 差异有统计学意义(P< 0.05)。 见表 2。

2.3 相关性分析 大鼠爪印印迹PLF、TSF、ITF 3个因子与 MWT 呈正相关（P< 0.05），其中 PLF 相关性显著。 见表3。

表2 大鼠OA 模型爪印印迹相关因子PLF、TSF、ITF 比较()

表2 大鼠OA 模型爪印印迹相关因子PLF、TSF、ITF 比较()

注:与同组内造模前(第0 d)比较,①P ＜ 0.05

造模时间 (d) PLF TSF ITF 0 0.02±0.01 0.03±0.02 0.04±0.02 7 0.12±0.04 0.12±0.04 0.05±0.02 14 0.18±0.02 0.14±0.04 0.07±0.04 21 0.23±0.05 0.16±0.05 0.09±0.03 28 0.31±0.04 0.21±0.06 0.10±0.04

表3 大鼠OA 模型爪印印迹相关因子PLF、TSF、ITF 与MWT 相关性分析

3 讨论

利用MIA 造模是研究OA 疼痛时较为常见的一种造模方法，MIA 通过破坏软骨细胞糖酵解，导致关节软骨丢失以及软骨下骨重建，疼痛变化显著[9]。 本研究结果显示，随着造模时间延长，MWT 逐渐降低，大鼠实验侧后肢的疼痛程度不断加重，这与其他文献报道的结果相一致[8-10]，证实本研究成功建立了MIA诱导的OA 疼痛模型。

爪印印迹相关因子起初应用于坐骨神经及跟腱功能的评估，功能受损后，动物后爪行走状态以及与接触地面的着力点都会发生改变，因此，爪印印迹间接反映了功能受损程度。 但是， 在OA 模型中， 动物是否会因为疼痛导致行走步态发生改变，致使爪印印迹的相关测量数值变化还尚未研究。 本研究结果显示， 爪印印迹相关因子PLF、TSF 及ITF随造模时间逐渐增大，3 个因子的数值代表了实验侧与正常侧PL、TS、IT 之间的差异， 数值越大表示差异越明显。相关性分析显示，3 个因子均与反应疼痛程度的MWT 呈正相关，且PLF 相关性显著。笔者认为，一方面，由于膝关节软骨退变、骨赘形成等导致关节活动受限，关节运动功能障碍引起行走步态改变；另一方面，关节病理学改变后，一系列炎症因子和致痛因子引起中枢及外周神经敏化，促进疼痛信号传递，痛觉敏化使大鼠后爪蜷缩，行走时接触地面范围及受力减少。所以在OA 模型中，大鼠爪印印迹相比正常侧有明显改变。 因此，爪印相关因子可以用来反映大鼠OA 模型的疼痛， 并且成为可能替代von Frey 的另一种疼痛评估方法。

近年来，CatWalk 步态分析仪逐渐被用于评估多种疼痛模型的疼痛学行为[11-12]。 它使用便捷、测量迅速且相较于von Frey 更为客观，但价格昂贵这一缺点使多数研究者望而却步， 这可能也是von Frey仍然被广泛使用的原因之一。 爪印印迹分析只需研究者自制避光狭长走道，配备不同颜色染料，成本极低。 爪印印迹也与动物的步态相关，由于步态改变，疼痛一侧的后爪接触范围缩小，间接反映了实验动物的疼痛程度。相较于von Frey，爪印印迹分析避开了人为主观评估这一因素， 应用Image J 标尺直接测量，增加了其客观性。 而在动物本身的影响性这一方面，von Frey 虽然在测量前先让动物适应一段时间，尽量减少这种影响，但是动物自身对疼痛的敏感性这一因素是不可避免的， 包括CatWalk步态分析仪。

虽然本研究通过相关性分析证实了爪印相关因子与经典的von Frey 机械缩足阈值具有相关性，但是本研究样本量有限，后续尚需扩大样本量后进行深入探究。 综上，爪印印迹分析成本低、易操作、结果客观，在今后的实验性疼痛评估中可能具有重要意义。