新疆双峰驼乳清对棕榈酸损伤MIN6细胞的保护作用

侯志梅，刘宸，梁敏，丁雪，王桂玲，冯鑫欢，杨洁

(1.新疆医科大学第二附属医院，乌鲁木齐 830063；2.新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830046；3.米东县人民医院，新疆 米泉 831400)

0 引 言

糖尿病是全球发病率较高的疾病，根据国际糖尿病联盟统计，目前全球糖尿病患者已达到4.25亿人口，而中国的糖尿病人口数为全球首位，已经达到了1.1亿人且呈上升趋势[1]。糖尿病又分为1型糖尿病和2型糖尿病，其中1型糖尿病是一种自身免疫性疾病，以胰岛β细胞损伤为主要表现[2]。2型糖尿病又称为胰岛素非依赖性疾病，通常由于胰岛β细胞分泌胰岛素不足或者靶细胞对胰岛素不敏感所致，也叫做非胰岛素依赖性糖尿病[3]。而胰岛β细胞的主要功能是分泌胰岛素，其数量的减少是造成机体持续高血糖的主要原因之一[4]。因此，促进胰岛β细胞增殖，抑制其凋亡是延缓并减少糖尿病发生的关键，也是开发糖尿病治疗药物的重要思路[5]。脂毒性是导致胰岛β细胞凋亡是糖尿病发病及恶化的重要原因[6]，且棕榈酸可通过抑制Akt磷酸化，引发一系列炎症反应，产生脂毒性，造成细胞的凋亡[7]；也可通过抑制细胞周期进程，影响β细胞的增殖[8]。研究表明PI3K/AKT信号通路在胰岛β细胞的增殖和凋亡方面发挥着重要作用[9-10]。目前治疗糖尿病主要靠服用α葡萄糖苷酶抑制剂、格列奈、磺脲类药物和双胍类药物，这些药物可以改善血糖调节，但对患者的健康有一些负面影响[11]。

驼乳自古以来就是新疆维吾尔族和哈萨克族人的治病良药，能够治疗肠胃炎、糖尿病、肾病、肺结核和肝病等疾病[12]。注射胰岛素是治疗糖尿病的常见方式，而驼乳中胰岛素样蛋白的含量较高，这也是驼乳相比其它乳制品的优势之一，不仅如此，驼乳中还富含与胰岛素家族相似的半胱氨酸[13]。同时由于驼乳中的胰岛素体积较小以及结构的特殊性，使得它相对容易成为血液循环中的一部分，不容易在胃酸中被破坏[14]，这也可能是口服驼乳能够降低血糖的原因之一。已有动物实验证明，驼乳能够显著的修复胰岛β细胞，恢复其分泌胰岛素的功能[15]。在链脲佐菌素诱导的糖尿病动物模型中，胰岛β细胞受到破坏，而摄入驼乳后胰岛β细胞数量增多[16]。同时口服驼奶还可以有效预防高血糖、高血脂和胰岛素抵抗等症状[17]。且研究发现，糖尿病小鼠灌胃驼乳清后，血糖水平下降，AKT上调，降低细胞的凋亡[18]。但驼乳清对小鼠胰岛β细胞株（MIN 6细胞）机制尚未清楚。本次研究旨在细胞水平上探讨驼乳清是否能够对MIN 6细胞的损伤起到保护作用，同时对其信号通路的影响作出初步探讨，为进一步研究骆驼乳治疗糖尿病的分子机制做铺垫。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

MIN 6细胞株购自ATCC，新鲜骆驼乳购自新疆乌鲁木齐市红雁池；胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS），BI公司；青霉素-链霉素双抗（Penicillin-Streptomycin，PS），美国Gibco公司；1640培养基，美国Hyclone公司；磷酸缓冲盐溶液，美国Hyclone公司；台盼蓝，BI公司；细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒，碧云天公司；棕榈酸，北京索莱宝科技有限公司；四甲基偶氮唑盐（MTT），Sigma公司；二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO），Sigma公司；二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DM SO），Sigma公司；0.25%胰蛋白酶，美国Hyclone公司；聚丙烯酰氨凝胶电泳试剂，北京索莱宝科技有限公司；蛋白Marker（分子量11-245ku），武汉博士德生物工程有限公司；鼠抗GAPDH单克隆抗体、鼠抗PI3Kp85多克隆抗体、兔抗AKT多克隆抗体、山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗，Elabscience公司；ECL化学发光底物，赛国生物科技有限责任；TRIzol试剂、FastQuant RT Kit（含gDNase）、SYBR Green PreMix Plus，天根生化科技有限公司。

1.2 主要仪器与设备

Heraeus Multifuge 8R离心机，赛默飞世尔科技公司；ALPHA 1-2 LD真空冷冻干燥机，德国Martin CHRIST公司；MDD-U 53V超低温冰箱，日本SANYO公司；1300 SERIESA2生物安全柜，赛默飞世尔科技公司；CO2恒温培养箱（FORMA DIRECT HEAT），赛默飞世尔科技公司；ELX 808全自动酶标仪，美国BioTek Instruments；Vert.A1荧光倒置显微镜，德国ZEISS公司；BOI-RAD转膜仪，伯乐生命医学产品有限公司；ImageQuant LAS 4000化学发光成像仪，美国GE公司；Light cycler 480实时荧光定量聚合酶链式反应仪（real-time polymerase chain reaction，PCR），瑞士罗氏公司。

2 实验方法

2.1 驼乳清制备

新鲜乳样品用尼龙滤布（200目）过滤除杂，鲜乳4℃下，于5 000 r/min，离心20 min，去脂；10%冰乙酸调节p H至4.6，40℃水浴20 min，4℃静置4 h；5 000 r/min，4℃离心，弃去沉淀（酪蛋白）；留上清液，即乳清；乳清样品-70℃预冷过夜，低温冷冻干燥后-20℃储存备用。

2.2 细胞培养

MIN 6细胞培养于12%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的1640培养基中。在37℃、5%培养箱中进行培养。待细胞密度达到80%，弃去培养基，无菌PBS清洗2遍后加入0.25%胰酶消化，加入培养基终止消化，反复轻轻吹打使细胞均匀分散，取适量细胞悬液置于新培养瓶中，一般按1∶3比例传代后放入CO2培养箱中继续培养。根据程瑞婷[19]等实验方法上进行优化，用棕榈酸分别作用MIN 6细胞12 h、24 h和36 h，计算出IC50分别为0.374 mmol/L，0.218 mmol/L和0.117 mmol/L，最后选择浓度为0.374 mmol/L PA作用于细胞12 h，构建细胞损伤模型，即为糖尿病中胰岛细胞损伤模型（DM）。

2.3 MTT法测量细胞活性

待细胞生长至70%～80%后加入胰酶消化，消化后将细胞稀释制成1×105个/mL的细胞悬液，150μL/孔接种于96板中，待其贴壁后，弃上清，用含有0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL的驼乳清(CW)的培养基，每孔加入200μL进行12 h和24 h干预。实验结束后，弃去上清液，每孔加入20μL MTT（终浓度为5 mg/mL）培养4 h，弃去上清，每孔加200μL DMSO溶解结晶颗粒（另设6个空白孔），于490 nm波长处测定OD值。建立M IN 6细胞损伤模型后，同时加入含有0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL的CW培养基进行干预，相同方法测量细胞活性。称取8 mg的驼乳清溶于2 mL的培养基中，其浓度为4 mg/m L，过滤除菌，再吸取1 mL的4 mg/m L的培养基，不含驼乳清的1 mL新的培养基中进行梯度稀释，后面浓度按照上述方法依次进行。

相对细胞活力（%）=（试验组OD值-空白OD值）/（正常组OD值-空白OD值）×100%

2.4 细胞形态观察

观察MIN 6细胞生长状态稳定，建立损伤模型后，加入含有1 mg/mL的CW培养基1 mL/孔接种于24孔板中，培养干预12 h后弃去培养基，加入0.5%台盼蓝100μL/孔进行染色，静置5 min后，每组随机取视野显微镜下拍照，以正常培养基培养的细胞为对照组，计算抑制率：抑制率（%）=处理组染蓝色平均细胞/对照组细胞总数×100%。相同处理后在倒置相差显微镜下观察细胞形态并拍照。同上述操作培养12 h后，根据细胞凋亡Hoechst染色试剂盒相关使用说明进行染色并拍照。

2.5 蛋白免疫印迹法

检测PI3K和AKT基因相对表达RIPA蛋白裂解液裂解提取蛋白，BCA试剂盒测定蛋白的浓度后定量，按照比例加入上样缓冲液，100℃加热变性。进行10%的SDS-PAGE凝胶电泳后，转至PVDF膜上。封闭PVDF膜2 h，将一抗按照1∶1000比例稀释后，一抗孵育过夜，于TBST漂洗PVDF膜后，孵育二抗(1∶5000)1 h，再次用TBST和TBS反复漂洗3次，ELC化学发光法检测目的蛋白的强度。所有实验均重复3次。

2.6 RT-q-PCR

根据TRIzol提取RNA的方法依次加入氯仿、异丙醇、体积分数75%乙醇溶液提取RNA，然后根据FastQuant RT Kit（含gDNase）说明书要求，以总RNA为模板逆转录为cDNA片段。以cDNA为模板，分别加入PI3K、AKT和GAPDH的特异性引物（序列见表1），按照SYBR Green qPCR PreMix试剂盒说明书操作方法进行扩增。用2－ΔΔCt法计算相对表达量。所有实验重复3次。

表1 qPCR引物序列

2.7 数据统计学分析

所有数据使用GraphPad Prism 5.0进行分析，实验结果以X±S表示，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

3 结 果

3.1 驼乳清对MIN 6细胞增殖的影响

不同浓度的的CW分别作用MIN 6细胞12 h和24 h，CW对MIN 6细胞相对活力的影响结果如图1所示。经CW干预12 h后，细胞活力均有增加，除4.00 mg/mLCW组细胞的增殖率较对照组明显增加外（P＜0.05），其余各组与对照组比较均无显著性差异（P＞0.05）；当用不同浓度的CW干预MIN 6细胞细胞12 h和24 h后，细胞增殖率与对照组相比均无显著差异（P＞0.05）。说明CW对MIN 6细胞无细胞毒性。

3.2 驼乳清对棕榈酸损伤MIN 6细胞增殖的影响

通过MTT实验检测不同浓度的CW对PA损伤后细胞的保护作用，结果如图2所示。经PA干预12 h后，与对照组相比，糖尿病组细胞相对活力减少38.6%（P＜0.05）。与糖尿病组相比，不同浓度的CW（0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL）处理使得相对细胞活力分别增加了48.8%、43.4%、31.2%、94.6%、125.4%和33.5%，其中CW 1.00、2.00 mg/mL组与糖尿病组有显著差异（P＜0.01）。当CW和PA作用时间达到24 h时，与对照组比较，糖尿病组相对细胞活力降低46.6%（P＜0.01）；与糖尿病组相比，CW 0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL组细胞的相对细胞活力分别增加20.4%、30.2%、57.6%、116.5%、107.9%和82.7%，其中CW 1.00、2.00、4.00 mg/mL组细胞的相对细胞活力与糖尿病组相比，差异极显著（P＜0.01）。实验结果表明，一定浓度的CW可以减少棕榈酸对MIN 6细胞损害，显著增加细胞的活力。

3.3 驼乳清对棕榈酸损伤的MIN 6细胞存活的影响

用CW和PA共同干预MIN 6细胞12 h后用台盼蓝染色检测细胞活性，结果见图3。由图可知，对照组细胞形态规则，糖尿病组细胞形态不规则，且被染蓝色细胞数目增多，台盼蓝着色清晰，染色聚集，细胞抑制率达到28.6%；CW组细胞形态完整，台盼蓝着色的细胞数较少，细胞的抑制率为3.6%。表明CW 能够保护PA损伤的MIN 6细胞生长，具有一定抗损伤活性。

图1 驼乳清对MIN6细胞增殖的影响

图2 驼乳清对棕榈酸损伤的MIN6细胞增殖的影响

图3 MIN6细胞台盼蓝染色

棕榈酸作用于MIN 6细胞12 h后，细胞变小且皱缩，形态改变。经添加CW 1.00 mg/mL和PA对MIN 6细胞共同作用12 h后，细胞损伤明显减轻，皱缩细胞较PA损伤的细胞明显减少。同样证明了CW对MIN 6细胞的PA损伤具有明显保护作用。

图4 驼乳对棕榈酸损伤的MIN6细胞形态形态的影响

3.4 驼乳清对棕榈酸损伤的MIN 6细胞凋亡的影响

与对照组相比，糖尿病组可看到凋亡细胞的细胞形态不规则，胞核呈致密浓染。CW组细胞形态规则，偶见Hoechst着色细胞。表明CW具有较好的抗损伤活性，可抑制PA诱导的MIN 6细胞凋亡。

图5 MIN6细胞Hoechst染色200×

3.5 驼乳清对MIN 6细胞PI3K/Akt相关因子蛋白表达的影响

同样将细胞处理后，检测对照组、模型组和CW组中MIN 6细胞PI3K和AKT蛋白质相对内参基因GAPDH的相对表达。图6中结果显示MIN 6细胞损伤后PI3K和AKT蛋白显著下调，经CW处理后其蛋白表达量上调，且差异极显著（P＜0.01），这说明CW对小鼠胰岛β细胞的保护作用可能跟PI3K、AKT的表达有关，表达上调后能够促进胰岛β细胞的增殖，抑制细胞的凋亡。

图6 MIN6细胞中PI3K、AKT蛋白表达结果（±S，n=3）

3.6 驼乳清对MIN 6细胞PI3K/Akt相关因子mRNA表达的影响

由图7知，模型组与对照组相比，PI3K，AKT基因显著下调，在加入驼乳清后，基因表达上调，且差异极显著（P＜0.01）。这说明CW组分对M IN 6细胞有保护作用，有效减少细胞凋亡，这可能与PI3K/AKT信号通路有关。

4 讨 论

结果说明，CW能够有效保护棕榈酸损伤后的MIN 6细胞，通过台盼蓝染色和显微镜观察发现，驼乳清可以改善胰岛β细胞的损伤。Hoechst染色也可观察到，驼乳清组分对胰岛β细胞有保护作用，有效减少细胞凋亡，同时激活了PI3K/AKT的表达。

图7 MIN6细胞PI3K、Akt基因的相对表达量

糖尿病形成的主要原因是胰岛β细胞损伤，功能逐渐衰退，分泌胰岛素能力下降或丧失而导致胰岛素绝对不足，导致血糖升高，危害身体健康，易发生酮症酸中毒[20]。因此，保护胰岛β细胞不受损害，促进胰岛细胞的增殖，对辅助治疗糖尿病具有重要意义。驼乳中富含大量矿物质、维生素和脂肪以及具有免疫调节作用的良好膳食[21-22]。且有动物实验表明骆驼乳能够治疗糖尿病，修复胰岛β细胞功能，增强免疫力并能够有效控制肾病、视网膜病变和伤口愈合等糖尿病并发症[23-24]。PI3K/AKT信号通路是细胞一个重要的信号通路，在细胞的增殖、分化、衰老和凋亡方面发挥着重要作用[25]。且在链脲佐菌素诱导的2型糖尿病中，由于炎症导致的胰岛β细胞凋亡和神经系统紊乱，被证明可能与PI3K/AKT的信号通路被抑制有关[26]。PA是一种可以产生胞脂毒性的物质，且破坏胰岛β细胞功能，当胰岛β细胞受损时，机体胰岛素分泌不足，导致血液循环中葡萄糖无法或较少被肝脏、脂肪组织或肌肉等利用，血糖升高。本次实验中利用PA构建出MIN 6细胞损伤模型，结果发现PA可诱导MIN 6细胞产生凋亡，使MIN 6的细胞活力下降，凋亡细胞的数量明显增加；CW具有较好的胰岛β细胞保护作用，减少PA对胰岛β细胞MIN 6损伤产生的细胞凋亡。同时我们对其信号通路作用机制做出探讨，发现CW调节了PI3K/AKT信号通路，说明我们的CW极有可能使通过调节该信号通路来对细胞的凋亡起到抑制作用，能够保护胰岛β细胞的损害，促进其增殖从而改善糖尿病。

综上所述，驼乳清作用于棕榈酸损伤的MIN 6细胞后，能够对细胞起到保护作用，其机制可能是通过激活了PI3K/AKT信号通路有关，从而发挥抑制细胞凋亡的作用。