青海酸奶中乳酸菌的分离鉴定及抑菌谱研究

（武警工程大学 装备管理与保障学院，西安 710086）

0 引 言

青海高原酸奶中含有多种天然抑菌物质，具有维持肠道菌群平衡，提高机体免疫力，促进营养物质的吸收等功能[1-6]。产细菌素的乳酸菌来源非常广泛[7-8]。本试验以我国部分地区高原自然发酵酸奶为试验材料，通过高效的定向筛选方法筛选乳酸菌素的产生菌株，对其发酵液生物学特性进行初步研究，并对筛选得到的菌株进行了个体形态、常规生理生化鉴定[9-12]及16SrDNA测序等系统的鉴定试验，以获得抑菌活性高、遗传特性稳定的乳酸菌素产生菌，为实现食品防腐剂的广谱、无毒化提供新的菌株资源。

1 实 验

1.1 材料与试剂

材料：高原自然发酵酸奶，采自青海牧区牧民家中。

菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、保加利亚乳杆菌、溶血链球菌、单增李斯特菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、番茄灰霉病菌、香蕉炭疽病、水稻纹枯病、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、荧光假单胞菌、藤黄微球菌、酒精酵母、啤酒酵母、黑曲霉、黄曲霉菌，均由陕西师范大学食品工程与营养科学学院微生物实验室提供。

试剂：酵母膏、牛肉膏、琼脂、蛋白胨等，均为生物试剂；硫酸镁、葡萄糖、磷酸氢二钾等，均为分析纯；MRS培养基、M 17琼脂培养基、改良的M 17G培养基，按文献[5，17]进行配制。PCR反应所需药品、PCR引物、PCR基因测序等委托上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 仪器设备

高压蒸汽灭菌锅，北京发恩科贸有限公司；生物洁净工作台，苏州苏净集团安泰公司；水浴恒温振荡器，太仓市仪器设备厂；DYY-8型稳压稳流电泳仪，上海琪特分析仪器有限公司；紫外分光光度计，上海分析仪器总厂；CENTRIFUGE 5804R离心机，EPPENDORF公司；隔水式电热恒温培养箱，江苏国华电器有限公司；电泳仪，北京六一仪器厂；PCR反应扩增仪，加拿大BBI公司；电子天平，北京赛多利斯天平有限公司；OLYMPUS BH 2显微镜，日本OLYMPUS公司；WET-SPM-9500J3原子力显微镜，日本岛津公司；移液器，加拿大BBI公司；VITEK全自动微生物检测系统，法国生物梅里埃公司；数码相机，日本佳能公司；革兰氏阳性菌鉴定卡试验(GPI)，法国生物梅里埃公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的定向分离[9]

（1）乳酸链球菌素母液的配置。称取100 mg乳酸链球菌素（原始效价为1 000 IU/mg），溶于20 mL 0.02 mol/L盐酸溶液中，此时效价为5 000 IU/mg，使用前需经孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤除菌。

（2）菌株的分离。本研究51个菌株分离自青海高原自然发酵酸奶，分别取从不同采样地采集的高原酸奶样品，按1%接种量加入到含乳酸链球菌素和溴甲酚紫的M 17G液体培养基中，28℃培养24 h，把M 17G液体培养物制成10-4、10-5、10-6稀释度的菌悬液，分别吸取0.1 mL放入M 17固体分离培养基上，涂布，28℃培养24 h，挑选单菌落，在分离培养基上划线，反复3次。

（3）抑菌活性及抑菌谱测定。采用改进滤纸片法[13-15]，该方法直观，能准确反映抑菌效果。将保藏的金黄色葡萄球菌或其他细菌转接至活化培养基，于37℃培养18 h，使菌体恢复生理活性。用血细胞计数板对活化好的金黄色葡萄球菌菌液进行计数，用无菌水将菌液浓度调至106mL-1。将无菌滤纸片（d=6mm）放入乳酸菌发酵液中，浸泡30 min后取出滤纸片，贴于已涂布有浓度为106mL-1的金黄色葡萄球菌菌液的检测平板上，置于恒温培养箱培养，在37℃下培养24 h，用游标卡尺测量抑菌圈大小，取3次实验平均值。

1.3.2 菌株的鉴定

（1）形态学观察。观察菌落形态，革兰氏染色后于显微镜下观察菌体形态[12]。

（2）原子力显微镜分子形貌观察。将制备好的菌液用生理盐水稀释后涂于AFM专用载玻片上，自然干燥，采用日本岛津公司的SPM 9500J3型原子力显微镜,室温下大气环境中对菌液的分子形态进行扫描观测。图像均在Tapping模式下获得，探针为Si3N4(微悬臂长：200μm，弹性系数0.12 N/m)，原子力显微镜图像的形态学特征(如高度、宽度等)均采用原子力显微镜附带的软件进行分析。

（3）生理生化鉴定。主要采用柠橄酸盐利用试实验、吲哚实验、甲基红(M.R)实验、v-p实验、）明胶液化实验、接触酶实验、葡萄糖氧化发酵、产氨试验及糖发酵实验等对菌株进行生理生化鉴定，具体方法参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册》（第八版）[16]。

（4）16Sr DNA序列分析[14-15]

1）DNA的提取。本研究使用上海生工生物技术公司提供的细菌基因组抽提试剂盒来提取DNA。

2）DNA检测。用含有0.5μg/mL EB的0.8%琼脂糖凝胶进行电泳，在凝胶成像系统下拍照，记录结果。

3）16SrDNA基因的PCR扩增

①16SrDNA扩增的引物。用于反应的引物采用16SrDNA的PCR反应的通用引物，引物的合成由上海生工生物技术公司完成。正向引物(P1)：5'-AGAG TTTGATCCTGGCTCAG-3';反向引物(P2)：5'-CTA CGGCTACCTTGTTACGA-3'。

②PCR反应体系

③PCR扩增条件。94℃预变性4 min，94℃变性1.5 min，53℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，共完成35个循环以后，72℃继续延伸10 min，4℃保存。

④PCR扩增产物检测。用含有0.5μg/m L EB的0.8%琼脂糖凝胶进行电泳，在凝胶成像系统下拍照，记录结果。

⑤16S rDNA序列分析和同源性比较。将Z103菌株的PCR扩增产物委托上海生工生物技术公司进行序列测定，得到的测序结果通过BLAST在Gen-Bank+EMBL+DDBJ基因库中进行同源性比较，从中得到菌株的序列信息。

（5）抑菌谱的测定。将供试菌种接种培养（细菌在37℃培养24 h，酵母菌和霉菌在28℃培养48～72 h）后，用血细胞计数板对活化好的菌液进行计数，用无菌水将菌液浓度调至106CFU/mL。用改进滤纸片法测量抑菌圈大小。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离与筛选

从青海高原酸奶中，采用定向分离乳链菌肽产生菌的方法：即在蔗糖作碳源和添加适当乳链菌肽的改良M 17培养基上，以溴甲酚紫作指示剂，如一个菌株对乳链菌肽具有抗性，又能利用蔗糖，使菌落周围培养基由紫色变为黄色，很容易用肉眼识别。然后检测该菌株是否产生抑菌物质。分离到51株使培养基变黄的菌株，其中Z 103菌株的稳定性、抑菌性好，因此选为实验菌株，如表1和表2所示。

2.2 菌株的鉴定

2.2.1 形态学鉴定

将Z103菌株接种于改良的M 17G培养基上，35℃培养1 d后观察菌落。菌落呈乳白色，隆起，外形光滑，湿润，小白色颗粒沉淀，无菌膜、气泡（图1（a））。细菌革兰氏染色阳性，球状，无荚膜和芽孢（图1（b））

表1 初筛分离的菌株

表2 菌株发酵产物效价测定

图1 Z103菌株菌落图和Z103革兰氏染色

2.2.2 原子力显微镜观察Z103菌株的分子形貌

由图2可以看出，在20.00μm×20.00μm的观测范围内Z103菌株的分子图像清晰、稳定，结构呈规则球形，形态饱满，表面有很多突起。

2.2.3 菌株的生理生化特征

Z 103菌株常规生理生化鉴定结果如表3所示。

图2 原子力显微镜观察Z103菌株

表3 常规生理生化鉴定结果

综合菌株培养特征、个体形状及生理生化特性鉴定结果，参照《伯杰细菌鉴定手册》(1994）[16]、根据东秀珠主编《常用细菌系统鉴定手册》（2001）[17]和凌代文、东秀珠主编《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》（1999）[18]，将Z103菌株初步鉴定为乳球菌属（Lactococcus）中的乳酸乳球菌乳酸亚种（L.lactis subsp.Lactis）。

2.2.4 Z 103菌株的16SrDNA序列分析

（1）基因组DNA的提取结果。基因组DNA的提取结果如图3所示。

图3 基因组DNA的提取

（2）Z103菌株的16SrDNA PCR扩增结果。以菌株Z103的基因组DNA为模板，利用PCR技术扩增16S rDNA片段，得到琼脂糖凝胶电泳的结果如图4所示。

图4 16Sr DNA PCR扩增

（3）Z 103菌株的16SrDNA序列分析。Z103菌株的16S rDNA PCR扩增产物委托上海生工生物技术公司进行序列测定，测出Z103菌株的16SrRNA基因序列总长为1 329 bp，得到的测序结果如图5所示。

（4）BLAST同源性搜索与系统发育树的绘制。将16S rDNA PCR扩增测得的序列，在GenBank+EMBL+DDBJ基因库进行同源性搜索，发现菌株Z103和Il1403、IL1403菌株的16S rDNA基因序列相似性达98.6%，在所有比较的菌株中相似性最高。而且，Z 103菌株的生理生化特征和Il1403、IL1403菌株的传统形态学特征基本吻合，因此确定Z103菌株为乳酸乳球菌乳酸亚种的一种。

综合同源性比对结果和Il1403、IL1403菌株在细菌发育系统中的位置，从GeneBank中选择8个菌株的16Sr DNA基因序列，通过Bioedit7.0.1和MEGA4.0.2软件进行多重比较后构建系统发育树，见图6。

图5 菌株Z103的16SrRNA基因序列

图6 基于16SrRNA基因序列的Z103菌株系统发育树

2.2.5 Z 103菌株抑菌谱测定

Z 103菌株抑菌谱测定结果如表4所示。由表4可以看出，Z 103菌株具有较广的抑菌谱，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌和霉菌作为检测指示菌。从表4中还可以看出，它对食源性致病菌，如金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和溶血链球菌等具有很好的抑制作用；对食品腐败菌，如藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、荧光假单胞菌等抑制作用较好，显示了在食品防腐作用中的应用潜力。但对霉菌和酵母菌没有作用。对很多植物的致病菌如香蕉炭疽病、番茄灰霉病菌、水稻纹枯病、油菜菌核病菌等有很好的抑制作用，说明它在植物疾病的防治方面也有很好的作用。

表4 乳酸菌产抑菌物质的抑菌谱

3 结 论

本研究从青海高原酸奶中定向分离得到的乳酸菌经形态学、原子力显微镜观察、生理生化及分子生物学鉴定，确定为乳酸乳球菌乳酸亚种。采用改进滤纸片法研究Z103菌株对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌和霉菌作为检测指示菌的抑菌性，通过实验可以看出，它不但对革兰氏阳性菌有效，而且对部分革兰氏阴性菌都有较强抑制作用，显示了它在食品保鲜防腐和植物疾病的防治方面的应用潜力。也说明其具有较广谱的抗菌活性。