亚硫酸铋琼脂平板培养基验收研究

金倩仪

（中山市食品药品检验所，广东中山 528437）

在微生物的试验过程中，培养基的质量直接影响检验结果，这其中包含了培养基自身质量的优劣、配制和使用方法是否正确、保存是否符合条件等过程[1-2]。沙门氏菌检验是食源性微生物检测的常规项目，该项检测实验中使用的培养基为亚硫酸铋（BS）琼脂培养基，检测中一般购买商品化的BS琼脂平板直接进行菌种检测，也可购买BS琼脂干粉制作平板用于检测（现用现配），培养基中的亚硫酸铋指示剂可以抑制革兰氏阳性菌和大肠菌群生长，但不影响沙门氏菌的生长。

在沙门氏菌检验中，BS琼脂平板培养基的质量关系到沙门氏菌检测结果的准确性。因此，选择伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠埃希氏菌和粪肠球菌4种菌株对BS琼脂培养基进行选择性和生长率的检验，探究影响BS琼脂平板培养基验收结果的相关因素。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

伤寒沙门氏菌[CMCC(B)50071]，广东省微生物菌种保藏中心提供；鼠伤寒沙门氏菌[ATCC 14028]、大肠埃希氏菌（ATCC 25922）、粪肠球菌（ATCC 29212），美国 MicroBioLogics ATCC。

Quintix2102-1CN电子天平，赛多利斯贸易有限公司；KB400生化培养箱，宾德亚太有限公司；SG603A-HE生物安全柜，美国BAKER公司。

1.2 检验环境

遵循无菌操作原则在二级生物安全实验室进行检测。

1.3 试验方法

1.3.1 平板制作

称取适量的亚硫酸铋琼脂干粉加水进行煮沸灭菌，待冷却至40 ℃后倾注平板（直径90 mm的平皿，通常要加入15～25 mL琼脂培养基），放到水平平面待琼脂凝固。需要在使用前一天配置，可常温放置于生物安全柜到第2天直接使用。

1.3.2 接种方法

伤寒沙门氏菌（菌株T1）和鼠伤寒沙门氏菌（菌株T2）作为目标菌，采用目标菌半定量方法。如图1a所示，用1 μL的接种环分A、B、C、D四个区进行划线，A、B、C三个区按0.5 cm的间隔划4条平行线，D区内划一条连续的曲线[3]。大肠埃希氏菌（N1）和粪肠球菌（N2）作为非目标菌，采用非目标菌半定量方法。如图1b所示，用1 μL的接种环取1环工作悬液在待测培养基表面划6条平行线。接种后的平板倒置培养于（36±1）℃培养箱中40～48 h。

图2 目标菌和非目标菌半定量划线法接种模式图

1.3.3 试验设置

选用同一生产厂家两个批号的BS琼脂干粉配制新鲜培养基并制作BS琼脂平板（命名为BS1、BS2）和另一生产厂家两个批号的商用BS琼脂平板（BS3、BS4），分别使用4种菌株（T1、T2、N1、N2）的新、旧菌株进行划线和菌种培养。

1.3.4 接种结果评价

培养后，评价菌落的形状、大小和生长密度，并计算生长指数G。每条有比较稠密菌落生长的划线则G为1；如果仅有一半的线有稠密菌落生长则G为0.5；如果没有菌落生长、生长量少于划线的一半或菌落生长微弱则G为0[4]。记录每个平板的得分总和便是G值，目标菌的G值一般是≥6，非目标菌的G值一般≤1。

2 结果与分析

不同类型、不同批号的亚硫酸铋琼脂平板的验收结果如表1所示。BS1使用鼠伤寒沙门氏菌（T2）旧菌株划线的平板生长指数不符合标准要求，但是用新菌株划线的平板是符合要求的；BS2的所有菌株划线的平板都在标准要求范围内，因此该批号的BS琼脂干粉培养基通过了培养基验证；BS4琼脂平板使用伤寒沙门氏菌（T1）划线的平板均没有生长，且使用粪肠球菌（N2）旧菌株划线的平板生长指数也超出标准要求；BS3琼脂平板使用伤寒沙门氏菌（T1）旧菌株划线其生长指数偏低，且粪肠球菌（N2）旧菌株的划线平板也超出了正常生长。为此，对所有菌株进行一次验证实验，发现粪肠球菌（N2）的旧菌株受到了污染，有杂菌；同时，旧菌株活性比新菌株差，因此旧菌株的结果不可作为培养基验收结果。由于BS4琼脂平板的伤寒沙门氏菌（T1）的G值不符合标准要求，判定该批次的平板不合格。

表1 亚硫酸铋琼脂验收实验结果

GB 4789.28-2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求》表明，每次进行验收都应进行菌株的纯度和形态验证，在保存和使用时应注意避免交叉污染，本次实验可说明使用后的菌株不宜反复使用，最好是当天废弃销毁。每次打开后易交叉污染，一旦发现菌株有污染现象应立即处理掉并换新的工作菌株，且旧的菌株即便是不被污染，也可能会因为传代次数过多而失去活力。运输条件和储存条件对培养基质量影响也是不可忽视的，对温度有要求的培养基应在收到后立即转存。生产商在送出时也应该和物流沟通好，确保运输过程中不会影响到培养基的质量。而且平板的配置、储存也有一定的要求，一般已配置的平板保存不超过4周，且要求保存在2～8 ℃条件下。已配置的平板在使用前也要观察是否有异常，而BS平板配置与一般培养基不同，需要在使用前一天配置，可常温放置于生物安全柜至第2天使用。如果培养基购置后还未进行培养基验证又需要立即使用时，可以进行实验的时候同时进行培养基的验收实验，在用实验生长出的菌进行平板划线时同时使用阴阳性菌株划线，通过结果反馈来验证培养基是否符合验收标准，在得到比较准确的验收结果的同时，观察培养基在日常检验中的使用状况。

3 结论

同一生产商不同批号、不同状态生产的培养基质量有优劣之分并不稳定。因此，培养基验收实验[5-6]是不可或缺的一个步骤，这直接影响了实验结果。不同的培养基应参照GB 4789.28-2013《食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求》进行验收试验。实验室可以多采购不同品牌的培养基使用，通过多次验收实验以及使用心得来选购符合本实验室实际状况的培养基。