马泡瓜多糖抗尿路感染的药效学研究

2021-05-12孙士浩马晓琴祁得胜马建滨

生物化工 2021年2期

孙士浩，马晓琴，祁得胜，马建滨

（青海师范大学，青海西宁 810008）

马泡瓜（Cucumis melo L.var.agrestis Naud.）属葫芦科黄瓜属植物，味甘、性凉、无毒性，具备清热解毒、利尿等功效，民间常用其煮汤治疗泌尿系统炎症[1]。

尿路感染（Urinary tract infection，UTI）是临床上常见的细菌感染疾病，发病率仅次于呼吸道感染[2]，致病菌多为革兰氏阴性杆菌，最常见为大肠杆菌，常用广谱抗菌药物进行治疗。但泌尿道病原菌的耐药性不断变化，给临床用药带来困难，也促使研究人员开始寻找一些疗效较好、安全性较高的抗菌中草药进行开发和研究。目前，马泡瓜在民间常作为中草药偏方使用，通过查阅文献，针对其在尿路感染方面的研究未见报道。本研究通过小鼠大肠杆菌泌尿道上行性感染模型进行实验，观察马泡瓜多糖的抗尿路感染作用，旨在为其功效和应用提供药理实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验药品与菌种

马泡瓜果实购自山东单县种植基地，切片后晒干备用。菌株有金黄色葡萄球菌、大肠杆菌，为实验室保藏菌。

乙醇，分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司；苯酚，分析纯，无锡市晶科化工有限公司；硫酸，分析纯，永飞化学试剂有限公司；左氧氟沙星片（批号B14202003159），第一三共制药有限公司。

1.1.2 培养基

牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，按照文献方法制作后备用[3]。

1.1.3 动物

KM小鼠（雌性，体重20～22 g）及动物饲料均由重庆腾鑫生物技术有限公司提供，自由摄食和饮水。

1.2 方法

1.2.1 马泡瓜多糖的制备

三是做大水利投融资平台。省政府成立了省水利发展投资有限公司，注册资本金50亿元，主要由省财政注资，采取多元投资方式，省水利厅管理为主，通过市场融资，解决湖南省水利建设投入不足的问题。各市县水利投融资平台通过财政注入资金、金融机构贷款、土地储备等方式，融资90亿元。

称取马泡瓜果实干片200 g，按料液比（干果实∶水）1∶10，浸泡过夜后煎煮2次，每次2 h。合并提取液，过滤后减压浓缩至200 mL，浓缩液中加入95%乙醇使其醇浓度达到60%，静置24 h，过滤后收集沉淀物并加水溶解，离心过滤后减压浓缩至200 mL，加95%乙醇使含醇量达80%，静置24 h，过滤，收集沉淀物，真空干燥，得马泡瓜多糖提取物。采用苯酚-硫酸法[4]测定总糖含量。

1.2.2 抗菌活性的测定（打孔法）

挑取活化好的菌落，悬于无菌生理盐水（高压灭菌锅121 ℃湿热灭菌）中，调整菌液浊度与比浊管（0.5麦氏单位）相同，其浓度约1×108CFU/mL，4 ℃冷藏备用。将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基溶化后倒入无菌平皿约15 mL，冷却至50～60 ℃，凝固后取菌液0.2 mL于平皿中，涂布均匀。用无菌镊子将灭菌后直径6 mm的圆形滤纸片置入不同剂量的马泡瓜多糖溶液中（空白组0 g/mL、低剂量0.250 g/mL、中剂量0.500 g/mL、高剂量1.000 g/mL），完全浸湿后取出，彻底挥干后贴于培养基表面，每种菌3次重复。在培养箱中37 ℃下培养1 d。取出培养皿后，肉眼观察纸片周围有无抑菌圈形成，若有抑菌圈则用游标卡尺测其直径，取3次测量的平均值[5]。

抑菌效果判定方法：抑菌圈直径＞15 mm为高度敏感，用“+++”表示；10～15 mm为中度敏感，用“++”表示；7～9 mm为低度敏感，用“+”表示；无抑菌圈表示无抑菌作用，用“-”表示[6]。

1.2.3 小鼠泌尿系统感染实验

根据参考文献[7]，利用针头经尿道插入膀胱注射菌液的方法，制造小鼠泌尿道上行性感染模型，从而研究受试药物疗效。选取健康小鼠70只，按体重随机分成7组，每组10只。空白对照组1组，阳性对照药物（左氧氟沙星）和受试药物分别设高、中、低3个剂量组（2.000 g/mL、0.500 g/mL、0.125 g/mL）。禁水24 h，用戊巴比妥钠溶液（70 mg/kg）腹腔麻醉，按压腹部排尽余尿，用酒精消毒尿道口及周围，将静脉留置针缓缓插入尿道至膀胱底部，用注射器注入大肠杆菌菌液0.05 mL（浓度约1×108CFU/mL）感染。4 h后恢复正常饮水进食。膀胱感染当天开始灌胃给药，每日给药1次，连续4 d。阴性对照组给予等容积的生理盐水。在第5 d断颈处死小鼠，无菌环境中取出双侧肾脏，纵切成剖面，将剖面盖印于平皿琼脂培养基上。然后将肾脏放入无菌研磨器中，每1 g组织加入9 mL生理盐水研磨，匀浆液适当稀释后涂布在平皿琼脂培养基上。两种平皿均置于37 ℃环境下培养18 h，记录活菌数并计算动物的细胞数（CFU/g）。

肾剖面盖印结果分级记录标准[8]：“++++”为细菌密集生长，范围达接种面积的90%以上；“+++”为细菌大量生长，出现的菌落无法计数；“++”为培养板上出现的菌落可计数，且≥20；“+”为培养板上出现的菌落数≥3且＜20；“±”为培养板上出现的菌落数＜3；“-”为培养板上无细菌生长。

结果使用SPSS13.0软件进行方差分析，比较各组差异显著性。由于肾组织匀浆菌落计数结果和肾剖面盖印结果方差不齐，分别使用极差法检验和秩和检验。

2 结果与分析

2.1 提取结果

经过提取和纯化，从马泡瓜中得到较纯的多糖，得率为27.5%。

2.2 抗菌活性测定结果

不同剂量马泡瓜多糖抑菌圈直径的比较结果见表1。从表1可以看出，马泡瓜多糖的1.000 g/mL和0.500 g/mL剂量组对大肠杆菌的抑制效果最强，抑菌圈直径＞10 mm，属中敏感度；0.250 g/mL剂量组对大肠杆菌的抑菌圈直径＞7 mm，属低敏感度。马泡瓜多糖的1.000 g/mL剂量组对金黄色葡萄球菌的抑制效果最强，抑菌圈直径＞10 mm，属中敏感度；0.500 g/mL剂量组对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径＞7 mm，属低敏感度；0.250 g/mL剂量组对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径＜7 mm，无抑菌作用。

表1 不同剂量马泡瓜多糖抑菌圈直径比较单位：mm

2.3 小鼠泌尿系统感染实验

受试药物及阳性对照药物对泌尿系统感染模型小鼠的疗效见表2和表3。受试药物高、中、低3个剂量组肾组织匀浆菌落计数对数值与对照组相比，分别下降了2.51、0.56、0.50，其中高剂量组（2.000 mg/kg）显著低于对照组（P＜0.01）；对照药物左氧氟沙星高、中、低3个剂量组肾组织匀浆菌落计数对数值与对照组相比，分别下降了3.00、2.24、1.29，均显著低于对照组（P＜0.01或P＜0.05）。受试药物与同剂量的左氧氟沙星相比，2.000 mg/kg剂量组的肾组织匀浆菌落计数无显著差异（P＞0.05），0.500和0.125 mg/kg剂量组肾组织匀浆菌落计数显著高于同剂量的左氧氟沙星（P＜0.05），表明在较高剂量下，马泡瓜多糖提取物与左氧氟沙星治疗泌尿道感染小鼠方面有相似疗效。

表2 大肠杆菌泌尿道感染的疗效测定结果（肾组织匀浆菌落计数，n=10）

表3 大肠杆菌泌尿道感染的疗效测定结果（肾剖面盖印，n=10）

肾剖面盖印结果同样显示，与对照组相比，受试药物2.000 mg/kg、0.500 mg/kg剂量组均有显著疗效（P＜0.01或P＜0.05），对照药物左氧氟沙星2.000 mg/kg、0.500 mg/kg、0.125 mg/kg剂量组均有显著疗效（P＜0.01）。受试药物与同剂量的左氧氟沙星相比，2.000 mg/kg、0.500 mg/kg剂量组的肾剖面盖印结果无显著差异（P＞0.05），0.125 mg/kg剂量组肾剖面盖印结果显著低于同剂量的左氧氟沙星（P＜0.05）。