海拔高度与藏族人群肠道菌群的宏基因组学关联分析

梁 田，马利锋，张致英，刘丽军，刘 芳，董文学，李 靖，张 寒，蒋雅琼，白 骕，康龙丽

（1.西藏民族大学高原病分子机制与干预研究省级重点实验室，陕西 咸阳712082；2.西藏民族大学环境与疾病相关基因研究高校重点实验室，陕西 咸阳712082；3.拉萨市城关区扎细社区卫生服务中心，拉萨850000）

人类肠道微生物的数量约为1011～1012个，是人体细胞数量的10 倍[1].肠道菌群在维持机体消化和心血管系统的正常生理代谢方面发挥着重要作用.肠道菌群紊乱可诱发多种代谢性疾病，如炎症性肠病、胃肠癌症、肝硬化、胰腺癌、糖尿病和肥胖等[2].作为地球上最极端地区之一，青藏高原平均海拔约4 000 m，强紫外线、低压、低氧和寒冷是高原环境的主要特点[3].严酷的生存环境使高原藏族人群机体发生了适应改变[4]，包括血红蛋白浓度低、肺动脉压低、低氧性肺血管收缩反应钝化、静息肺通气量高、一氧化氮呼气量高、运动耐力增强、慢性高原病发病率高等[5-6].藏族人群拥有与高原适应相关的EPAS1、EGLN1 和PPARA 基因，这些基因有助于机体更好地适应高原环境[7].另外，藏族人群肠道菌群中存在多种短链脂肪酸产生菌，可促进能量代谢和肠道菌群稳态[8].

外界环境、饮食、年龄及健康水平等因素都会影响宿主肠道菌群的构成[9].恶劣的高原环境可能会对微生物群造成巨大的进化压力，从而影响其多样性和群落组成[10-12]，如低温、低氧和强紫外线是影响人体肠道和皮肤菌群的重要因素[8，10].目前，关于肠道菌群的研究主要围绕在平原人群，关于海拔高度与肠道菌群的研究较少.本研究选取生活在高海拔地区的67名藏族人，对其粪便标本进行16S rRNA 基因测序. 本研究旨在揭示：①不同海拔高度藏族人群肠道菌群alpha 多样性和beta 多样性的差异；②不同海拔高度藏族人群肠道菌群的菌属丰度、biomarkers、微生物网络、基因通路、肠型的差异；③海拔高度与肠道菌群的alpha 多样性、beta 多样性和菌属丰度的相关性.

1 材料与方法

1.1 样本采集

以长期居住于西藏地区（平均海拔3 650～4 500 m）的67 名藏族居民为研究对象，其中31 人居住于海拔3 650 m（T3650），19 人居住于海拔4 000 m（T4000），17 人居住于海拔4 500 m（T4500）.收集藏族居民的性别、年龄、身高、体质量、身体质量指数（BMI）和饮食习惯（以动物为主要饮食、均衡饮食或以植物为主要饮食）等信息. 样本收集标准：①无消化道相关疾病；②3 个月内未使用抗生素；③未吸烟、饮酒.采集约2 g粪便样本置于10 mL 的无菌管内，将其保存于-80 ℃冰箱内待用.本研究通过西藏民族大学伦理委员会审批（ID：201601），实验过程严格遵守西藏民族大学生物安全标准.所有参与者充分了解实验目的并签署知情同意书.

1.2 细菌DNA 提取及PCR 扩增

使用TIANamp Swab DNA 提取试剂盒（中国上海生化科技有限公司）提取样本中的细菌总DNA，利用Nano Drop2000 分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific 公司）和1%琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的浓度、纯度并进行质量检测.利用341F 和805R 引物对细菌的16S rRNA 基因的V3～V4 区进行PCR 扩增.该扩增体系为：10×TransStart FastPfu 缓冲液1 μL，25 mmol/L dNTPs 0.8 μL，341F 和805R 引物（浓度均为10 μmol/L）各0.1 μL，TransStart FastPfu DNA 聚合酶0.2 μL，模板DNA 3 μL，ddH2O 4.8 μL.扩增流程：95 ℃，3 min；95 ℃，30s，55℃，30 s，72 ℃，30 s，进行27 个循环；72 ℃，10 min；最终维持在4 ℃.

1.3 DNA 文库构建和高通量测序

使用2%琼脂糖凝胶回收PCR 产物，利用AMPure XP beads 磁珠（美国Beckman Coulter 公司）进行纯化，Tris-HCl 洗脱后，利用QuantiFluorTM-ST 微型荧光计（美国Promega 公司）进行定量检测.最后利用Illumina MiSeq 平台进行2×250 双端测序.

1.4 原始序列处理

使用Trimmomatic 和FLASH 软件对原始FASTQ数据进行质控和拼接：①筛选长度在20～50 bp 的序列；②精确匹配barcode，删除引物大于2 个碱基的错配序列；③序列的两端序列拼接，筛选重叠碱基（＞10 bp）进行拼接. 利用UPARSE 软件，将序列按照97%的相似性进行OTU 聚类，并使用UCHIME 剔除可能存在的嵌合体.最后与Silva 数据库（SSU123）比对，使用RDP classifier（http：//rdp.cme.msu.edu/）对序列进行物种注释（比对阈值为80%）.

1.5 生物信息学及统计学分析

利用R 3.6.2（‘vegan’package）绘制物种积累曲线，使用Mothur 软件计算alpha 多样性[13].使用主坐标分析（PCoA）和非参数多元方差分析（PERMANOVA）进行beta 多样性计算. 基于OTU 水平和Jaccard 距离绘制PCoA[14].基于vegan 包，使用PERMANOVA 计算不同组间菌群群落结构的相似性[15]. 利用线性判别分析（LEfSe）筛选出不同组间存在显著差异的的biomarkers（LDA=2.0）[16].使用Kruskal-Wallis 秩和检验与Wilcox秩和检验对不同组间的菌属丰度进行统计学检验，使用错误发现率（false discovery rate，FDR）对P 值进行校正，P ＜0.05 认为是存在统计学意义. 使用Pearson相关性分析计算菌门丰度、菌属丰度、alpha 多样性、beta 多样性与海拔高度之间的相关性，当P ＜0.05 并且r ＞0.3 时认为相关具有统计学意义. 使用SparCC和Gephi 软件绘制微生物网络.使用PICRUSt 软件进行细菌的基因功能预测，并利用Enterotypes 网站（http：//enterotypes.org）进行肠型分类.

2 结果与分析

2.1 不同海拔高度藏族人群肠道菌群的物种组成

本研究收集了来自于西藏地区的67 个粪便样本，共获得5 212 480 条原始序列，在进行质量控制后获得4 785 985 条序列（平均序列长度为71 432，最大长度为98 661，最小长度为43 299），聚类产生20 031个OTU.不同海拔高度藏族人群的样本信息如表1 所示.由表1 可以看出，不同海拔高度藏族人群的体质量和BMI 无显著性差异（P ＞0.05），但是其身高差异显著（P ＜0.05）.不同海拔高度藏族人群的饮食习惯相似，均是以肉类为主，对于蔬菜和水果的摄入量较少.

表1 样本信息Tab.1 Information of samples

稀释曲线可用于评估样本测序量是否合理，当稀释曲线随着抽取序列数的增加而趋于平缓时，证明该样本的测序数据量合理.图1（a）中的稀释曲线表明该测序深度能够捕获大部分肠道菌群样本的细菌物种.在门水平上，藏族人群的肠道菌群主要由厚壁菌门（Firmicutes，46%）、拟杆菌门（Bacteroidetes，33%）、变形菌门（Proteobacteria，6%）、放线菌门（Actinobacteria，3%）和疣微菌门（Verrucomicrobia，3%）组成，如图1（b）所示.在属水平上，藏族人群的肠道菌群主要由拟杆菌属（Bacteroides，11.7%）、普氏菌属（Prevotella，10.4%）、小杆菌属（Dialister，6.64%）、粪杆菌属（Faecalibacterium，4.81%）、埃希菌属（Escherichia，3.43%）、罕见小球菌属（Subdoligranulum，3.13%）、颤杆菌属（Oscillibacter，2.73%）、阿克曼氏菌属（Akkermansia，2.71%）、考拉杆菌属（Phascolarctobacterium，1.87%）和瘤胃球菌属（Ruminococcus，1.6%）构成，如图1（c）所示.

图1 肠道菌群的测序质量和物种组成Fig.1 Sequencing quality and community composition of intestinal microbiota

2.2 不同海拔高度藏族人群肠道菌群的alpha 和beta 多样性对比

计算不同海拔高度藏族人群肠道菌群的alpha 和beta 多样性，结果如图2 所示. 由图2 可以看出，T3650 组的alpha 多样性明显高于T4000 和T4500 组（P=0.009），3 组之间的beta 多样性无显著性差异（P=0.26，R2= 0.03）.PCoA 分析结果表明，T3650、T4000和T4500 组间大部分样本聚集在一起，样本间距离较近.

图2 肠道菌群的多样性分析Fig.2 Comparison of the diversity of intestinal microbiota

Pearson 相关性分析结果如图3 所示.由图3 可以看出，藏族人群肠道菌群的alpha 多样性会随着海拔高度的升高而逐渐下降（Chao1，P ＜0.001；r=-0.40）（ACE，P ＜0.001；r = -0.42），但是beta 多样性不会受到海拔高度的影响，二者相关性较低（P=0.002，r=0.04）.

图3 肠道菌群多样性与海拔高度的相关性分析Fig.3 Pearson’s correlation analysis between altitudeand diversity of intestinal microbiota

2.3 不同海拔高度藏族人群的肠道细菌丰度对比

通过LEfSe 分析可以筛选出各组间丰度存在显著差异的biomarkers，结果如图4 所示.

图4 肠道菌群的细菌丰度对比Fig.4 Comparison of the relative abundance of bacterial genera

由图4（a）可以看出，T3650 组的biomarker 为古菌界、广古菌门、Δ-变形菌纲、甲烷杆菌纲、脱硫弧菌目、甲烷杆菌目、脱硫弧菌科、甲烷杆菌科、脱硫弧菌属和甲烷杆菌属；T4000 组的biomarker 为梭菌属；而T4500组的的biomarker 为细菌界.通过Pearson 相关性分析计算肠道菌属丰度与海拔之间的相关性，结果如图4（b）所示.在门水平，广古菌门的丰度随着海拔高度的升高而下降（r = -0.36，P ＜0.005）.在属水平上，脱硫弧菌属、甲烷杆菌属和艰难杆菌属的丰度随着海拔高度的升高而下降（r ＜-0.3，P ＜0.05）.

2.4 不同海拔高度藏族人群肠道菌群的微生物网络对比

为探讨海拔高度对肠道菌群微生物网络的影响，本研究对比了不同海拔高度藏族人群肠道的微生物网络结构特征，结果如图5 所示. T3650、T4000 和T4500 组微生物网络的节点和边的数量存在显著差异. T3650 组微生物网络中有26 个节点，28 条边；T4000 组微生物网络中有30 个节点，36 条边；T4500组微生物网络中有11 个节点，6 条边. T3650 组和T4000 组微生物网络的节点和边的数量明显高于T4500 组的微生物网络，并且T4000 组的微生物网络结构比T3650 组和T4500 组的微生物网络结构更加复杂，结构差异较大.

图5 肠道菌群的微生物网络分析Fig.5 Microbial network analysis of intestinal microbiota

2.5 不同海拔高度藏族人群肠道菌群的基因功能和肠型对比

为了解海拔高度对藏族人群肠道菌群基因功能的影响，利用PICRUSt 软件对肠道菌群进行基因功能预测，结果如图6 所示.由图6（a）可以看出，青霉素和头孢菌素生物合成、类固醇激素合成、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、β-内酰胺抗性通路在T3650、T4000 和T4500 组间存在差异，但是经FDR 校正后，差异不具有统计学意义.肠型可以对个体的肠道菌群进行准确描述，不会受到宿主的年龄、性别、文化背景和地理位置的影响.由图6（b）可以看出，藏族人群肠型主要为ET_P 肠型，随着海拔高度的增加，ET_F 肠型所占比例不断下降，而ET_P 肠型所占比例不断上升.

图6 肠道菌群的基因功能预测和肠型分析Fig.6 Gene function prediction and intestinal type analysis of intestinal microbiota

3 讨论与结论

物种多样性与生态系统的稳定性之间存在正相关关系，物种多样性越高，微生物群落越稳定[17].较高的物种多样性能够为微生物群落提供更多的缓冲能力，降低物种灭绝的可能性[18-19].微生物群落的多样性越高，其抵抗外界环境干扰的能力越强[18-19].本研究发现，藏族人群肠道菌群的alpha 多样性随海拔高度的增加而下降.Li 等[10]的研究也发现，高海拔人群皮肤菌群的alpha 多样性会显著低于低海拔人群.饮食与生活环境是影响宿主肠道菌群的2 个重要因素，本研究结果显示，不同海拔藏族人群的饮食习惯相似，因此推测T3650、T4000 和T4500 组间的alpha 多样性的差异可能与环境因素有关.肠道菌群的物种组成易受环境温度的影响，环境温度降低会导致菌群alpha 多样性降低[20-21].动物实验中也发现了随着温度的降低，小鼠肠道菌群的alpha 多样性会随之下降.Zietak 等[22]研究发现，长期生活在12 ℃的小鼠肠道菌群的alpha 多样性明显低于生活在29 ℃的小鼠的alpha 多样性，这是由于寒冷使机体的能量代谢速率加快，进而引起肠道菌群的alpha 多样性下降.低氧也会引起肠道菌群alpha多样性的下降，处于低氧状态的小鼠肠道菌群alpha多样性会明显低于处于正常氧浓度下的小鼠[23-24]，其原因在于低氧环境激活了宿主的氧化应激和炎症通路，从而间接导致肠道菌群alpha 多样性下降[23-24].本研究也得到了同样的结论：随着海拔高度的增加，环境中温度和氧气浓度不断下降，低温和低氧限制了环境细菌的生长繁殖，进而引起宿主从环境中获取的细菌数量和种类减少，最终导致肠道菌群alpha 多样性的下降[25].

遗传背景和饮食习惯是影响机体肠道菌群的重要因素，不同民族人群的肠道菌群结构差异显著，而相同民族人群的样本汇聚在一起时样本间距离较近[26].肠道菌群结构与饮食习惯也密切相关，如泰国人移居美国后，其饮食习惯逐渐西化，从而导致他们的肠道菌群结构与美国人的肠道菌群结构相似[9]. 本研究发现T3650、T4000 和T4500 3 组藏族人群的肠道菌群beta 多样性无显著性差异，其肠道菌群结构相似，推测是因为T3650、T4000 和T4500 3 组人群均为藏族遗传背景，且饮食习惯相似，所以他们的肠道菌群结构相似，差异不具有统计学意义.环境是影响肠道菌群结构的重要因素[9].随着海拔高度的增加，宿主生活环境中的氧浓度和温度不断下降.目前研究发现，低氧并不是影响肠道菌群结构的关键因素[23].如Lucking 等[23]研究发现，长期低氧状态下小鼠肠道菌群的群落结构与正常小鼠相似；Khanna 等[27]的研究也证实宿主处于低氧环境时，其肠道菌群结构并未发生改变.环境温度对宿主肠道菌群结构的影响也较小，如Li 等[28]研究发现，生活在温暖环境（22 ℃）的小鼠肠道菌群结构与生活在寒冷环境（4 ℃）的小鼠肠道菌群结构相似.目前，低温和低氧对于肠道菌群结构的具体作用机制尚未见报道.本研究也发现生活在不同海拔高度的藏族人群肠道菌群结构相似，无明显差异，因此推测低温和低氧等环境因素可能对藏族人肠道菌群结构的影响较小.

本研究发现T3650 组的biomarker 为脱硫弧菌属，而T4000 组的biomarker 为梭菌属.CD36 受体是一种与脂质吸收相关的受体，Li 等[28]的研究表明，梭菌属与脱硫弧菌属的代谢产物会分别抑制或促进CD36受体的表达，从而调节宿主的脂质吸收能力并影响肥胖.虽然T3650 组与T4000 组的BMI 指数不具有显著性差异，但BMI 相对较高的T3650 组中脱硫弧菌属的丰度也较高，而BMI 指数相对较低的T4000 组的梭菌属丰度较高.因此，肠道菌群中biomarker 的不同可能会引起宿主BMI 的差异.

本研究发现T3650 和T4000 组的微生物网络节点数目、边数和拓扑结构比T4500 组的微生物网络更多、更复杂.随着海拔高度的增加，肠道菌群的微生物网络更加脆弱.Li 等[10]对皮肤菌群的研究也发现，高海拔人群的微生物网络拓扑结构比低海拔人群更加脆弱.这是因为低温低氧环境导致肠道菌属的种类和丰度下降，从而造成微生物网络的节点和边的数量减少，其拓扑结构变得更加脆弱.T3650 组和T4000 组的微生物网络中拥有大量的梭菌属、布劳特氏菌属和霍尔德曼氏菌属，这些均为短链脂肪酸产生菌[29-30].由梭菌属、布劳特氏菌属和霍尔德曼氏菌属产生的短链脂肪酸可以通过激活G 蛋白偶联受体途径增强肠道黏膜免疫，增加alpha 多样性，维持肠道菌群的稳态[31].此外，短链脂肪酸可以降低宿主血压和肺动脉高压，保护心肌功能，帮助机体适应高原环境[32-33].

当宿主的膳食纤维摄入不足时，肠道细菌会利用肠腔内分泌的黏液作为反应底物[34-36].阿克曼氏菌属定殖于人体的肠黏液层，富含黏液降解酶（N-乙酰半乳糖苷酶），它可将黏液降解为糖，促进自身生长繁殖[34].本研究发现，在T4500 组的微生物网络中，阿克曼氏菌属的丰度较高，这可能与宿主对于蔬菜和水果的摄入量较少有关.另外，该组微生物网络中另枝菌属的丰度也较高，这是一种与海拔高度相关的标志物，其丰度与海拔高度呈正相关，并且可以耐受高原低氧条件[37]，因此T4500 组微生物网络中另枝菌属的丰度较高.另枝菌属与肠道炎症密切相关，可能会诱发溃疡性结肠炎、克罗恩病和直肠癌等肠道疾病.高丰度的另枝菌属与宿主肠道菌群alpha 多样性下降密切相关[38-39].本研究中藏族人群肠道菌群多样性的结果也支持以上观点，与T3650 组和T4000 组相比，T4500 组的alpha 多样性最低.相关性分析结果表明，广古菌门和甲烷杆菌属两种古菌的丰度会随着海拔高度的增加而逐渐下降.微生物网络结果显示，T3650 组和T4000 组的微生物网络中均含有大量短链脂肪酸产生菌，而T4500组中未发现短链脂肪酸产生菌存在，短链脂肪酸产生菌的代谢产物为两种古菌的增殖提供了反应底物.短链脂肪酸产生菌与古菌存在互利共生的关系[40]：短链脂肪酸产生菌的代谢产物氢气可以作为古菌的发酵底物；古菌消耗氢气生成甲烷的过程会抑制短链脂肪酸的发酵途径，从而使短链脂肪酸的产生量增加[40].因此，广古菌门和甲烷杆菌属两种古菌的丰度会随海拔高度的升高而逐渐下降.

普氏菌是ET_P 肠型的主要驱动菌属，它可以帮助机体分解蛋白质和饱和脂肪酸，合成维生素B1、叶酸等，维持机体正常代谢[41].本研究结果表明，藏族人群的肠型主要为ET_P 肠型，可能与其特殊的饮食习惯有关.由于藏族人对于蔬菜和水果的摄入量较少，肉类摄入量较多，因此导致其肠道菌群中普氏菌的丰度较高.随着海拔高度的增加，藏族人肠道中ET_P 肠型的比例逐渐增加，而ET_F 肠型的比例减少.ET_F肠型具有较高的微生物多样性，随海拔高度的增加ET_F 肠型比例减少也印证了肠道菌群的alpha 多样性与海拔高度呈负相关的结果[42].