不同剂量果王素对肺纤维化小鼠肺间质细胞FGF及VEGF表达水平的影响对比

陈荟婷 贺兼斌

【关键词】果王素;肺纤维化;碱性成纤维细胞生长因子;血管内皮生长因子

肺纤维化是一种具有相似病理过程的一类弥漫性肺间质疾病的总称，其病理过程中相对复杂，早期病理特征为弥漫性肺泡炎和肺泡结构破坏，增加呼吸衰竭、死亡率[1]。泼尼松是肺纤维化中常用的治疗方法，虽然能获得预期的效果，但是药物副作用较大，停药后复发率亦相对较高，导致临床使用受到限制。果王素为猕猴桃果仁经临界CO2萃取法提取的果仁油，主要成分为α-亚麻酸，含有一定量的维生素E和微量元素硒等，能发挥抗氧化、抗癌、保护正常细胞活性作用[2]。但是，果王素药物剂量及对肺纤维化小鼠肺间质细胞碱性成纤维细胞生长因子（FGF）及血管内皮生长因子（VEGF）的影响研究较少[3]。因此，本研究以8周龄SPF级小鼠作为对象，探讨不同剂量果王素对肺纤维化小鼠肺间质细胞FGF及VEGF的表达水平的影响，报道如下。

1 资料与方法

1.1 动物资料

购置SPF级小鼠128只作为对象，随机取8只，设为A组;剩余小鼠建立肺纤维化动物模型，建模成功后随机分为B组（24只）、C组（24只）、D组（24只）、E组（24只）、F组（24只）。128只SPF级雄性小鼠，体质量（210±15）g，清洁级。动物合格证号：SCXK（湘）2019-0014，将购置的小鼠均放置在医院动物房进行7 d适应性喂养。且对小鼠进行喂养、12 h交替光照。

1.2 仪器与设备

紫外分光光度计，型号：UV1700，购自于Pharmaspec，ShiMDAzu公司;石蜡包埋机购自武汉俊杰电子有限公司;病理切片机购自于上海徕卡仪器有限公司;显微镜购自于日本NiKon公司;TGL-16台式离心机购自于上海医用分析仪器厂;HE染色液购自于上海经科化学科技有限公司;泼尼松购自于广东邦民制药厂有限公司（国药准字H44021838）;中华猕猴桃果仁非饱和脂肪酸，购自于湘西老爹生物有限公司，为黄色油性液体，非饱和脂肪酸含量为600 g/L。

1.3 方法

（1）建模方法。128只小鼠随机取8只为A组，剩余120只小鼠采用注入博来霉素A5建立肺纤维化小鼠动物模型。建模小鼠均给予2%戊巴比妥钠45 mg/kg腹腔注射麻醉，并在无菌操作下正中下切开，充分暴露气管，行气管切管，并向气管内注入一次性博来霉素A5注射液，剂量5 mg/kg，直立小鼠并旋转，使得药液在肺内均匀分布，从而完成肺纤维化动物模型;A组则在气管内一次性注入相同体积0.9%氯化钠;（2）药物干预方法。各组小鼠于建模后第二天开始给药，A组、B组每天给予0.9%氯化钠2 mL灌胃1次，C组给予5 mg/kg醋酸泼尼松片溶于生理盐水中，2 mL灌胃;D组取果王素60 mg/ kg混合0.9%氯化钠注射液2 mL灌胃1次;E组取果王素120 mg/ kg混合0.9%氯化钠注射液2 mL灌胃1次;F组取果王素180 mg/kg混合0.9%氯化钠注射液2 mL灌胃1次，每天1次，连续用药28 d。

1.4 观察指标

（1）HE染色。6组均完成28 d干预，干预完毕后以断颈方式处死，取肺部病灶组织。经梯度酒精脱水后进行石蜡包埋，制备4 μm切片，中性树胶封片后，倒置显微镜下观察甲状腺的病理形态[4];（2）FGF、VEGF mRNA水平。各组小鼠于干预后7 d、14 d及28 d以断颈方式处死，取劲动脉血，并采用实时荧光PCR法测定各组小鼠FGF、VEGF mRNA水平，有关操作严格遵循试剂盒说明书完成[5]。采用Western Blot检测各组肺组织中FGF、VEGF 蛋白质的动态表达。

1.5 统计学分析

采用SPSS 24.0软件处理，计数资料行χ2检验，采用[n（%）]表示，计量资料行t检验，采用（x—±s）表示，P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色结果比较

各组小鼠均完成相应的处理，并完成HE染色，结果表明：对照组小鼠肺组织中未见肺泡炎、纤维化病变，肺泡结构清晰;模型组可见大量炎症细胞、肺泡间隔增宽，成纤维细胞大量增生并广泛纤维化;不同剂量果王素小鼠肺纤维化程度明显减轻，且高剂量与泼尼松小鼠改善最佳，见图1。

2.2 FGF、VEGF mRNA水平及蛋白比较

各组小鼠均给予相应的措施处理，并完成FGF、VEGF mRNA水平测定，结果表明：随着时间的延长不同剂量果王素组与泼尼松组FGF、VEGF mRNA水平呈下降趋势，不同时间点FGF、VEGF mRNA水平比较具有统计意义（P<0.05）;F组和C组FGF、VEGF mRNA水平无统计意义（P>0.05）;F组FGF、VEGF mRNA水平均低于D组和E组（P<0.05），见图2。

Western Blot检测结果表明：不同剂量果王素组与泼尼松组FGF、VEGF蛋白呈低表达;F组和C组FGF、VEGF蛋白无统计意义（P>0.05）;F组FGF、VEGF蛋白均低于D组和E组（P<0.05），见图3。

3 讨论

猕猴桃是世界公认的“水果之王”“世界珍果”，其营养丰富、全面，主要体现为“两高四多”，即：高钾、高钙、多亚麻酸、多维生素C、多粗纤维及多氨基酸。同时，猕猴桃种子中含有其核心营养物质α-亚麻酸，能通过“稀释血液”，调节血脂中过高的甘油三酯水平，保护心脏健康。现代药理结果表明[6]：果王素具有抗氧化、抗炎症及抗肿瘤等多种生物学效应，药用价值较高。本研究中，B组可见大量炎症细胞、肺泡间隔增宽，成纤维细胞大量增生并广泛纤维化;不同剂量果王素小鼠肺纤维化程度明显减轻，且高剂量与泼尼松小鼠改善最佳，从本研究结果看出，果王素用于肺纤维化小鼠中，能减轻肺损伤，且作用效果多呈剂量依赖性，能获得良好的预后。

FGF主要由内皮细胞、巨噬细胞与平滑肌细胞分泌产生，具有多种异构体，在动脉粥样硬化病灶中发挥了重要作用。既往研究表明[7]：FGF能促进内皮细胞的游走、平滑肌细胞的增殖，避免平滑肌细胞游走。同时，FGF亦可促进新生血管形成，修復损害的内皮细胞，被认为是病灶形成促进因子。而VEGF又称为血管通透因子，是一种高度特异性促进血管内皮生长因子，能促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞的迁移、增殖及血管的形成作用。FGF、VEGF在人体中呈低表达或处于动态平衡状态，但是在肺纤维化中能引起FGF、VEGF mRNA水平持续升高，其表达水平能反映肺纤维化的疾病严重程度，可指导临床治疗[8]。本研究中，随着时间的延长不同剂量果王素组与泼尼松组FGF、VEGF mRNA水平呈下降趋势，不同时间点FGF、VEGF mRNA水平比较具有统计意义（P<0.05）;F组FGF、VEGF水平均低于D组和E组（P<0.05）;Western Blot检测结果表明：不同剂量果王素组与泼尼松组FGF、VEGF蛋白呈低表达;F组和C组FGF、VEGF蛋白无统计意义（P>0.05）;F组FGF、VEGF蛋白均低于D组和E组（P<0.05），从本研究结果看出，果王素能降低肺纤维化小鼠FGF、VEGF mRNA水平，且高剂量果王素效果最佳，干预过程中加强FGF、VEGF mRNA水平测定，亦可评价小鼠预后。

综上所述，果王素用于肺纤维化小鼠中能减轻肺损伤，且呈剂量依懒性，可能与抑制FGF、VEGF mRNA水平有关，能为肺纤维化治疗提供新思路。