胸腺基质淋巴生成素对大鼠皮肤损伤修复作用及免疫机制研究

陈 骏

福建中医药大学附属第二人民医院急诊外科，福建福州 350003

皮肤损伤修复的分子机制仍未完全明确。辅助性T 细胞1（T Helper Tcells 1，Th1）与辅助性T细胞2（T Helper Tcells 2，Th2）平衡机制在皮肤损伤修复过程中发挥重要作用，相关的免疫调节因子已成为目前研究热点之一[1-3]。胸腺基质淋巴生成素参与调控Th1 与Th2 平衡，可能在Th2 相关的炎症性疾病的发生中起到主开关和调节器的作用[4]。目前，国内外对皮肤损伤修复中胸腺基质淋巴生成素免疫调节机制的研究仍较为少见。本研究监测了胸腺基质淋巴生成素的表达水平及相关炎症因子的浓度变化，为探讨皮肤损伤修复过程中的免疫机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物及主要试剂

SPF 级 雌 性 大 鼠52 只，6 ～8 周 龄，体 重180 ～200 g，购于北京隆安实验动物养殖中心，批号：SCXK（京）2014-0003，随机分为观察组与对照组，每组各26 只。主要试剂：血清胸腺基质淋巴生成素酶联免疫吸附检测试剂盒购于上海赛默科技生物发展有限公司；血清干扰素γ（Interferon γ，IFN-γ）、白细胞介素4（Interleukin 4，IL-4）、免疫球蛋白E（Immunoglobulin E，IgE）酶联免疫吸附检测试剂盒购于仑昌硕生物科技有限公司；兔抗鼠胸腺基质淋巴生成素多克隆抗体、免疫组化染色试剂盒均购于爱必信（上海）生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠皮肤损伤模型建立 观察组大鼠实验前1 周实验室喂养，温度22 ～24 ℃、湿度50%～60%，12 h 节律光照，自由饮食、进食。实验当日禁食，按30 mg/kg 剂量腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉，用8%硫化钠除净大鼠背部体毛，面积约8cm×8cm，使用特制致伤器在大鼠脊柱两侧旁2 cm切割4 个圆形创面，直径为1.5 cm，深至皮下，切割后止血。对照组大鼠仅背部脱毛。

1.2.2 血清胸腺基质淋巴生成素、IFN-γ、IL-4、IgE 检测 造模后第3 天，两组大鼠经腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉后，剪尾采血约0.3 ～5 ml/只，室温下静置10 min，4000 r/min 离心10 min，收集上层血清，采用酶联免疫吸附法测定血清胸腺基质淋巴生成素、IFN-γ、IL-4、IgE 浓度，试剂盒购于上海赛默科技生物发展有限公司。

1.2.3 免疫组化检测 取血后采集两组大鼠背部脱毛处的皮肤组织，用10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，0.4 μm 连续切片，行SP 法免疫组化染色，倒置显微镜下观察并拍照，使用Image-Pro Plus 5.0软件读取黄色或棕黄色细胞的光密度值。

1.3 统计学处理

使用SPSS 23.0 统计学软件分析，计量资料以（）表示，采用t检验，相关性分析进行Pearson分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化检测结果

胸腺基质淋巴生成素阳性表达于细胞核，在细胞膜和细胞浆中未见阳性着色。观察组平均光密度为（82.60±9.34），明显高于对照组的（50.38±3.91），差 异 有 统 计 学 意 义（t=24.381，P=0.000）。见图1。

图1 两组大鼠皮肤组织免疫组化检测结果（SP×400）

2.2 两组血清胸腺基质淋巴生成素、IFN-γ、IL-4、IgE水平比较

观察组大鼠血清胸腺基质淋巴生成素、IL-4、IgE 水平明显高于对照组，IFN-γ 水平明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 两组血清胸腺基质淋巴生成素、IFN-γ、IL-4、IgE水平比较（±s）

表1 两组血清胸腺基质淋巴生成素、IFN-γ、IL-4、IgE水平比较（±s）

组别 n胸腺基质淋巴生成素（pg/ml）IFN-γ（ng/ml）IL-4（ng/ml）IgE（ng/ml）对照组26 138.24±20.51 72.46±7.58 62.48±6.70 15.91±4.65观察组26 226.91±27.73 49.18±4.63 97.62±9.95 132.43±12.08 t 值 21.373 13.409 15.194 29.558 P 值 0.000 0.003 0.000 0.000

2.3 观察组血清胸腺基质淋巴生成素与IFN-γ、IL-4、IgE相关性分析

Pearson相关性分析显示，观察组大鼠血清胸腺基质淋巴生成素与IFN-γ 呈负相关（r=-0.731，P＜0.01），与IL-4、IgE 呈正相关（r=0.683，0.719，P＜0.01）。

3 讨论

胸腺基质淋巴生成素是白细胞介素17（Interleukin 17，IL-17）的类似物，在正常小鼠上皮中不表达，但在特应性皮炎小鼠上皮细胞中存在高表达[5]。近年来研究显示，胸腺基质淋巴生成素可通过激活树突细胞表达OX40 共刺激因子，启动表面抗原分化簇4 受体（ cluster of differentiation 4 receptors，CD4+）T 细胞分化，生成Th2 促炎症因子，促进炎症介质大量生成，启动过敏性炎症反应[6-8]。肿瘤坏死因子超家族成员（OX40 ligand，OX40）仅表达于活化的T 淋巴细胞表面，下调OX40 表达能够有效抑制胸腺基质淋巴生成素诱导的特应性炎症反应[9]。激活的树突细胞能够合成并分泌细胞因子白细胞介素18（Interleukin 18，IL-18），直接参与炎症反应过程，并产生炎症聚集效应[10-11]。胸腺基质淋巴生成素直接作用于肥大细胞，促进Th2 细胞因子和促因子[12-14]。临床研究发现，特应性皮炎患者中胸腺基质淋巴生成素高表达能够上调白细胞介素13（Interleukin 13，IL-13）水平，促进皮肤纤维化[15]。但目前关于胸腺基质淋巴生成素在皮肤损伤修复中作用的研究较少。皮肤损伤修复包括肉芽组织增生、其他组织再生、瘢痕形成等一系列过程，炎症反应在其中发挥重要作用[16-17]。

皮肤损伤修复过程中免疫炎症反应主要包括IgE 升高、Th1/Th2 失衡且以Th2 占优势以及由此引发的炎症介质和细胞因子异常分泌[18]。Th2 细胞亚群主要分泌IL-4、白细胞介素10（Interleukin 10，IL-10）等炎症因子，Th1 细胞亚群主要分泌IFN-γ、IL-2 等炎症因子[19-21]。本实验通过建立大鼠皮肤损伤模型，免疫组化检测结果显示，胸腺基质淋巴生成素阳性表达于大鼠细胞核，且观察组阳性表达率明显高于对照组。观察组大鼠血清胸腺基质淋巴生成素、IL-4、IgE 水平明显高于对照组，IFN-γ 水平明显低于对照组。其原因可能为，胸腺基质淋巴生成素激活树突细胞，促进CD4+T 细胞增殖活化为Th2 细胞，IL-4 分泌量明显增加[22-23]；同时Th2 水平上升造成Th1 水平下降，IFN-γ 合成量减少[24-25]。相关性分析显示，观察组大鼠血清胸腺基质淋巴生成素与IFN-γ 呈负相关，与IL-4、IgE 呈正相关。提示胸腺基质淋巴生成素通过影响IFN-γ、IL-4、IgE 表达来调节免疫系统功能，介导大鼠皮肤损伤的修复过程[26-27]。在以后的研究中可采用Western blot、RT-PCR 等技术从蛋白和基因水平上进一步探讨胸腺基质淋巴生成素在皮肤损伤修复过程中的作用机制。