冰黄肤乐软膏体外抗炎抗菌及皮肤毒性评价研究

刘春梅 雷 佳 周志宏 安彩艳

1.内蒙古自治区巴彦淖尔市医院检验科，内蒙古巴彦淖尔 015000；2.内蒙古自治区巴彦淖尔市医院消化内科，内蒙古巴彦淖尔 015000；3.内蒙古自治区巴彦淖尔市医院心内科，内蒙古巴彦淖尔 015000；4.内蒙古医科大学附属医院，内蒙古呼和浩特 010110

炎症是由免疫系统的各种协同成分介导的对组织损伤的保护性和修复性反应[1]。临床中较多使用西药进行抗炎抗菌治疗，当用西药作单一治疗剂时，在治疗过程中耐药性的出现限制了西药的疗效。萨沃亚（Savoia）对植物来源物质的潜在抗菌活性进行的一项研究表明，大约30%的筛选草药显示出潜在的体外抗菌活性[2-4]。“冰黄肤乐软膏”也是天然产物复合物的混合物，包括黄芩、姜黄、硫黄、大黄、甘草、冰片和薄荷脑[5]，临床中常用于消炎、止痒、皮炎和湿疹[6-7]。本实验通过建立大小鼠炎症模型、体外的抗菌活性评价和皮肤刺激性评价，旨在为临床外用制剂的应用与开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验药物及试剂

皮炎平（华润三九药业股份公司，批号1901005H）；冰黄肤乐软膏（西藏海容唐果药业有限公司，批号190502）；LB 培养基（购自北京陆桥，批号1807061、1091331）；YM 培养基（青岛海博生物，批号20180915、20181015）；二甲苯（天津市富宇精细化工，批号2018 年6 月14 日）。

1.2 菌种

绿脓杆菌（ATCC27853）；金黄色葡萄球菌（ATCC25923）；白色念珠菌（ATCC14053），储存于巴彦淖尔市医院检验科微生物室。

1.3 动物

KM 小鼠60 只，雌雄各半，5 ～6 周龄，体重18 ～22 g；SD 大鼠60 只，雌雄各半，5 ～6 周龄，体重170 ～250 g，北京维通利华实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2012-0001。健康成年家兔8 只，体重1.8 ～2.2 kg，购自苏州湖桥生物，实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2015-0002。

1.4 方法

1.4.1 大鼠足趾肿胀实验[8]60 只SD 大鼠，随机分为冰黄肤乐软膏低、中、高剂量组（25、50、1 0 0 mg/只）、模型组（生理盐水，作为阴性对照组）、基质组（50 mg/只）、皮炎平组（50 mg/只，作为阳性对照组），每组雌雄各5 只。涂药部位于大鼠右后足背，连续涂药7 d，每天涂药频率为1 次。第7 天涂药前，测量大鼠右后足容积，之后进行各组涂药，涂药剂量同前，涂药后用1%角叉菜胶0.1 ml/只注射于大鼠右后足皮下，注射完成后进行计时，并于1、2、3、4 h 后再次测量大鼠右后足容积。

1.4.2 小鼠耳肿胀炎性抑制实验[9]60只KM小鼠，随机分为冰黄肤乐软膏低、中、高剂量组（12.5 、25、50 mg/只）、模型组（生理盐水，作为阴性对照组）、基质组（25 mg/只）、皮炎平组（25 mg/只，作为阳性对照组），每组雌雄各5 只。涂药部位位于小鼠右耳内外双侧，连续涂药7 d，每天涂药1 次。末次涂药1 h 后用酒精棉球擦净耳部药物，滴二甲苯30 μl/只于右耳内外两侧，20 min 后，眼眶采血1 ml，血液分析仪测定白细胞，之后处死。用直径为6 mm 的打孔器在两耳相同的部位取下左、右圆耳片，称重，计算耳肿胀度。

1.4.3 抑菌实验[7]配制LB 和YM 培养基，分装于三角瓶中，121℃灭菌20 min，备用。精密称取冰黄肤乐软膏样品，溶于二甲基亚砜中，以蒸馏水稀释成1 g/ml 工作液。取灭菌试管12 支，编号1—12，取工作药液200 μl，加入LB 或YM 液体培养基1.8×103μl，制成终浓度100 mg/ml 含药液培养基，同法依次制得50 ～0.39 mg/L 含药液培养基，分别加入105CFU/ml 金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌或白色念珠菌50 μl 混匀。编号为10—12 管分别为不加菌液的试药对照、加不含药物培养基的菌株对照、加夫西地酸或者氟康唑的阳性对照。培养48 h，挑取不混浊、肉眼观察无微生物生长的培养物接种于相应固体培养基，继续培养48 h，如菌株未生长，该稀释倍数为药物对该菌株的最小抑菌浓度（MIC）。

1.4.4 皮肤刺激性评价及组织病理学检查[10]给药前一天使用8%硫化钠对背部脊柱双侧8 cm×8 cm范围进行脱毛处理。每只家兔左上、左下、右上、右下脊柱区分别为完整皮肤刺激实验区域（软膏100 mg/次）、完整皮肤空白对照区域（基质100 mg/次）、破损皮肤刺激实验区域（软膏100 mg/次）、破损皮肤空白对照区域（基质100 mg/次）。用灭菌的医用纱布贴敷6 h，除去纱布后1、24、48、72 h 对皮肤状况进行观察，如有无红斑及红肿的情况，并做记录。给药周期7 d，给药频率1 次/d。在观察期结束时取皮肤进行组织病理学检查，并提供病理照片。

1.5 统计学处理

本研究数据采用SPSS 20.0 软件进行统计分析，计量资料用（）表示，经正态性和方差齐性检验后，采用单因素ANOVA或秩和检验进行分析，组间比较采用Bonferroni法进分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 冰黄肤乐软膏对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影响

冰黄肤乐软膏对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影响（图1），以皮炎平组、冰黄肤乐软膏低、中、高剂量组在各个时间点的大鼠足肿胀度与基质组和模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。冰黄肤乐软膏组与皮炎平组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），模型组和基质组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 冰黄肤乐软膏对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影响

2.2 冰黄肤乐软膏对二甲苯致小鼠耳肿胀及白细胞水平的影响

冰黄肤乐软膏对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响（图2），与模型组和基质组比较，皮炎平组和冰黄肤乐软膏低、中、高剂量组，能减轻二甲苯致小鼠耳肿胀，且差异有统计学意义（P＜0.05）。冰黄肤乐软膏组与皮炎平组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），模型组和基质组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。白细胞测定结果（图3），与模型组和基质组比较，皮炎平组和冰黄肤乐软膏低、中、高剂量组的白细胞水平降低，且差异有统计学意义（P＜0.05）。冰黄肤乐软膏与皮炎平组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），模型组和基质组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2 冰黄肤乐软膏对二甲苯致小鼠耳胀的影响

图3 冰黄肤乐软膏对白细胞水平的影响

2.3 冰黄肤乐软膏抗菌实验

冰黄肤乐软膏对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、和 白 色 念 珠 菌 的MIC 为3.12 ～6.25 mg/ml、3.12 ～6.25 mg/ml、1.56 ～3.12 mg/ml，夫西地酸作为金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌阳性药，其对两种菌的MIC 为1.56 ～3.12 mg/ml；氟康唑作为白色念珠菌的阳性药，其对白色念珠菌的MIC 为0.78 ～1.56 mg/ml。

2.4 冰黄肤乐软膏皮肤刺激性实验

冰黄肤乐软膏多次给药实验中，冰黄肤乐软膏与基质对完整皮肤均没有刺激性，冰黄肤乐软膏与基质对破损皮肤的具有轻度刺激性，并于第4 天消失。在观察期结束时取皮肤进行HE 染色及组织病理学检查，结果见图4。皮肤刺激性和组织病理学结果均显示冰黄肤乐软膏不具有皮肤刺激性。

图4 皮肤组织病理学检查（标尺100 μm）

3 讨论

炎症是一个复杂的过程，涉及多个事件，如酶激活，介质产生与释放，外渗液，细胞迁移，组织分解和修复[11]。在炎症反应中，IL-1、TNF-α、IL-2和白细胞水平会随之增加[12]。药物治疗后，上述炎症因子水平在一定程度上降低，表明该药物可以防止炎症反应的过度表达并加速伤口上皮的愈合[13]。皮肤表面有很多病原微生物，当皮肤发生炎症反应和受损时，炎症部位和伤口容易感染病原细菌[14]。因此，使用不同的实验模型进行药理试验是必不可少的。

用1%角叉菜胶0.1 ml/只注射于大鼠右后足皮下，可使局部前列腺素合成增加，与激肽类一起诱导形成组织水肿[15]。二甲苯会立即刺激小鼠的耳朵，从而导致积液并触发急性炎症反应。本研究发现冰黄肤乐软膏可显著降低角叉菜胶和二甲苯引起的水肿，提示冰黄肤乐软膏具有抗炎作用。白细胞水平检测说明冰黄肤乐软膏具有抗急性炎症的作用，同时相关文献[16]也报道了冰黄肤乐软膏对慢性炎症也具有抑制作用，如亚急性湿疹。

冰黄肤乐软膏由黄芩、大黄、姜黄、硫黄等多味组方组成，其中大黄对大肠杆菌和变形杆菌感染的腹膜炎小鼠模型有良好的保护作用[17]。黄芩茎叶中总黄酮对革兰阳性菌及白色念珠菌具有较强的抑制作用[18]。姜黄素腹腔注射制备小鼠细菌脓毒症模型，发现其可明显减少TNF-α、NO 和氧自由基产生，减轻脏器的病理损害。本实验表明，冰黄肤乐软膏对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌等体外抗菌活性良好，其MIC 略高于夫西地酸和氟康唑，可用于抗革兰阴性菌、革兰阳性菌及真菌的治疗。

软膏作为一种外用制剂，临床上主要应用于局部和透皮给药，具有有效成分吸收快、用量少、方便携带和方便储存的优点。本实验进行了动物皮肤刺激性及组织病理学评价，结果显示，冰黄肤乐软膏给药过程中发现，在几只破损皮肤动物模型中出现了轻度红斑，并在第4 天自行消失，由于破损皮肤屏障被破坏，因此该事件并不表明由于暴露于测试物质而产生了不良后果。另外，前期预实验结果表明，无剂量依赖性的趋势。

综上所述，冰黄肤乐软膏具有抗炎抗菌作用，同时无皮肤刺激性。为临床用药提供理论性和安全性依据，同时也为进一步研究其抗炎抗菌作用机制打下基础。