桃蛀螟气味结合蛋白CpunOBP3和CpunOBP4的基因克隆、原核表达及配体结合特性分析

郭洪刚, 魏春花, 张民照, 覃晓春, 杜艳丽

(北京农学院生物与资源环境学院, 农业农村部华北都市农业重点实验室, 北京 102206)

昆虫气味结合蛋白(odorant binding proteins, OBPs)是昆虫外周嗅觉系统气味识别过程中的先锋分子，其能够特异性地识别和筛选特定化学信号，进而将环境信号传至昆虫中枢神经系统，引发昆虫做出行为反应(Leal, 2013; 孙小洁等, 2020)。近年来，基于靶标昆虫的嗅觉通讯行为调控来实现害虫治理已成为有害生物绿色防控的热点，其中，昆虫气味结合蛋白是该项防治措施的一类重要靶标(Venthur and Zhou, 2018; 杜迎刚等, 2020; 孙小洁等, 2020)。因此，进一步识别和鉴定靶标昆虫的气味结合蛋白，了解其结构特点和配体结合特性，对开发新的杀虫剂，开展害虫生态防控，实现害虫综合治理至关重要。目前，已鉴定出不同昆虫的气味结合蛋白，并且发现昆虫行使嗅觉功能的大部分OBPs的基因均在触角中高表达，如嘴壶夜蛾Oraesiaemarginata的OemaPBP1,桃蛀螟Conogethespunctiferalis的CpunOBP1,CpunOBP2和CpunPBP2等,以及玉米象Sitophituszeamais的SzeaOBP35-36等(Fengetal., 2017; Geetal., 2018; Tangetal., 2019)。进一步研究表明，OBPs可以与寄主植物挥发物结合，影响昆虫与寄主植物间的信息交流，如：绿盲蝽Apolyguslucorum的AlucOBP22负责特异性识别β-紫罗兰酮(β-ionone)和β-石竹烯(β-caryophyllene)等萜烯类挥发物，参与绿盲蝽寄主定位和寄主转换(Liuetal., 2019)；烟粉虱Bemisiatabaci的BtabOBP3在其识别和选择健康植株而不选择病毒侵染植株的过程中具有重要作用(Shietal., 2019)。不仅如此，很多昆虫的OBPs还能识别昆虫性信息素[如地中海石蝇Ceratitiscapitata的CcapOBP22、苹果蠹蛾Cydiapomonella的CpomPBP2、大蜡螟Galleriamellonella的GOBP2等]、报警信息素[如豌豆蚜Acyrthosiphonpisum的ApisOBP3和禾谷缢管蚜Rhopalosiphumpadi的RpadOBP3和RpadOBP7]等，从而影响昆虫间的互作过程(交配、产卵和逃避等行为)(Sunetal., 2011; Fanetal., 2017; Falchettoetal., 2019; Lizanaetal., 2020; Tianetal., 2020)。而且，随着对OBPs研究的不断深入，发现OBPs还具有除嗅觉感知以外的其他生理功能。如AccOBP10基因参与中华蜜蜂Apisceranacerana响应非生物胁迫过程(Guoetal., 2021)；棉铃虫Helicoverpaarmigera的HarmOBP3和HarmOBP6基因参与调节昆虫的飞行能力(Wangetal., 2020)；小菜蛾Plutellaxylostella的PxylOBP13基因与该虫对菊酯类杀虫剂的抗性有关(Bautistaetal., 2015)。这些研究表明，OBPs不仅在昆虫化学通讯过程中(昆虫与寄主植物、昆虫与昆虫)发挥着重要的嗅觉作用，而且还行使除嗅觉以外的其他生理功能(杜亚丽等, 2020)。

桃蛀螟是一类以幼虫钻蛀危害板栗、桃、玉米、向日葵等多种果树和经济作物的多食性害虫。近年来，伴随着我国农业产业结构的调整，桃蛀螟为害亦日趋严重。如在黄淮海夏玉米和西南山地夏玉米产区，桃蛀螟在玉米果穗上的种群数量迅速增加，使其为害程度超过亚洲玉米螟Ostriniafurnacalis，成为当地夏玉米穗期的主要害虫(王振营和王晓鸣, 2015)。然而，由于桃蛀螟幼虫钻蛀为害的特性，幼虫期防治困难重重；目前有关成虫的防治措施也仅限于性诱剂，而性诱剂只对雄蛾有效，如果雄蛾在诱杀前已完成交配，对压低下一代虫口基数起不到任何作用。最近研究人员发现，通过设计特异性引诱剂或驱避剂来防治桃蛀螟或通过基因编辑等方式定向调控桃蛀螟等钻蛀类害虫的嗅觉行为符合环境友好和可持续发展理念的防治策略(杜艳丽等, 2014; 贾小俭等, 2015; Xiaoetal., 2016; 朱秀云等, 2017; 翟浩等, 2019)。但目前有关桃蛀螟气味结合蛋白的研究还较少，尚不能满足实际开发的巨大需求。基于此，本研究根据前期转录组数据(Jiaetal., 2016)，筛选鉴定两个桃蛀螟气味结合蛋白基因(CpunOBP3和CpunOBP4)，采用原核表达及蛋白纯化得到CpunOBP3和CpunOBP4重组蛋白，通过荧光竞争结合实验测定重组蛋白CpunOBP3和CpunOBP4与24种配体的结合能力，为探讨桃蛀螟感受气味化合物的分子响应机制提供一定的科学依据，为开发基于桃蛀螟气味结合蛋白的绿色防控措施提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

将2009年10月9日在北京农学院东大地玉米试验田采集桃蛀螟老熟幼虫，于实验室用新鲜甜玉米长期继代饲养，饲养条件：温度23±1℃，相对湿度70%±5%，光周期16L∶8D。本实验所用桃蛀螟成虫已在室内累计饲养80代，默认成虫羽化72 h后雌雄蛾完成交配。

1.2 触角总RNA的提取与cDNA第1链合成

分别取80对羽化后72 h的桃蛀螟雌、雄蛾触角置于1.5 mL离心管中，用RNeasy Plus Mini Kit试剂盒提取总RNA，于-80℃保存备用。经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测触角总RNA的完整性、核酸浓度测定仪(K5500)检测RNA样品的浓度及OD260/OD280值后，用反转录试剂盒(Promega Co., 美国)合成cDNA第1链，在-20℃保存备用。

1.3 目的基因片段扩增

基于前期桃蛀螟触角转录组测序数据，根据桃蛀螟CpunOBP3和CpunOBP4基因开放阅读框去信号肽序列后的序列，设计特异性扩增引物，依照pET-30a(+)质粒图谱在引物5′端添加内切酶酶切位点(表1)。以1.2节合成的cDNA为模板，分别利用特异性引物(表1)进行PCR扩增，反应体系(50.0 μL): ddH2O 21.3 μL, cDNA 模板1.7 μL, 2×ES Taq MasterMix 25.0 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各1.0 μL。反应条件: 94℃预变性5 min后进入40个循环(CpunOBP3: 94℃变性40 s, 57℃退火40 s, 72℃延伸10 min;CpunOBP4: 94℃变性40 s, 53℃退火40 s, 72℃延伸10 min)，之后72℃再延伸5 min。PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后，按TIANgel Midi Purification Kit试剂盒步骤纯化回收PCR产物。

1.4 生物信息学分析

桃蛀螟CpunOBP3和CpunOBP4序列通过DNAMAN 4.0软件进行分析，并利用在线软件(http:∥www.Expasy.org/compute_pi/)对CpunOBP3和CpunOBP4蛋白的等电点和分子量等基本物理性状进行预测；使用IPSORT(http:∥www.ipsort.hgc.jp/)对CpunOBP3和CpunOBP4蛋白的信号肽进行分析；利用MEGA5.0软件和邻接法(neighbor-joining, NJ)对序列进行1 000次重复构建，完成系统发育树的构建。

1.5 原核表达载体的构建

将1.3节胶回收产物与pMD-19T载体16℃过夜连接，连接产物转化至大肠杆菌EscherichiacoliDH5α感受态细胞中，涂布在LB平板(含100 μg/mL Amp)上，于37℃培养16 h构建T载体。T载体依次通过菌液PCR、双酶切和测序鉴定后，将测序结果与已知基因序列相同的菌液在LB液体培养基(含100 μg/mL Amp)中扩大培养，同时将实验室保存的pET-30a(+)菌种在LB液体培养基(含100 μg/mL Kna)中扩大培养，待菌液浑浊后，提取重组质粒pMD-19T/OBPs和pET-30a(+)，使用指定的限制性内切酶(表1)于37℃进行双酶切反应，再根据片段大小回收OBPs目的片段和表达载体，并检测回收产物的浓度和纯度。回收的OBPs目的片段和用同样内切酶切开的质粒pET-30a(+)于16℃过夜连接构建表达载体。表达载体先后经菌液PCR鉴定、双酶切鉴定和测序鉴定后，将测序正确的菌液加高温灭菌的甘油制成菌种保存液，-80℃保存备用。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.6 蛋白的诱导表达与纯化

将1.5节鉴定成功的重组质粒pET-30a/CpunOBP3和pET-30a/CpunOBP4活化后，参照贾小俭等(2015)的研究方法进一步诱导表达。取1 mL菌液作为未诱导样品，加入1 mmol/L的IPTG诱导表达6 h。期间，每隔2 h取1 mL菌液，12 000 r/min离心1 min后除尽上清，加100 μL ddH2O混匀。处理后的菌液，以未诱导菌液为阴性对照，用15% SDS-PAGE电泳检测不同时间段的诱导表达效果。参照贾小俭等(2015)的研究方法，将诱导好的CpunOBP3和CpunOBP4大肠杆菌菌液进一步纯化。由于CpunOBP3和CpunOBP4均为包涵体蛋白，所以利用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒进行蛋白纯化；蛋白纯化过程中收集洗脱峰，经电泳检测后在4℃下20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)中透析24～48 h，除去盐离子；随后采用重组肠激酶(欣百诺生物，上海)对纯化好的蛋白于37℃酶切16 h以去除 His-tag，将切除His标签的重组蛋白利用截留分子量规格为10 kD的超滤浓缩管将重组蛋白浓缩至1 mg/mL，于-80℃保存备用。

1.7 竞争性结合实验

参照贾小俭等(2015)的研究方法，利用多功能酶标仪，通过荧光竞争结合实验研究重组蛋白CpunOBP3和CpunOBP4与2种桃蛀螟性信息素和22种植物挥发物的结合能力。首先，分别检测CpunOBP3和CpunOBP4蛋白溶液与荧光探针1-NPN(Sigma Co.，德国)的解离常数Ki，然后测定蛋白与配体的结合能力，结合能力差异依据解离常数Ki值来比较。计算公式为Ki=[IC50]/(1+[1-NPN]/K1-NPN)(Banetal., 2003; 宋月芹等, 2014)，其中[1-NPN]为未结合的1-NPN浓度，K1-NPN为CpunOBP3/1-NPN或CpunOBP4/1-NPN蛋白的解离常数。

2 结果

2.1 桃蛀螟CpunOBP3和CpunOBP4基因的序列特征

对CpunOBP3和CpunOBP4基因氨基酸序列进行分析发现，CpunOBP3(GenBank登录号: GEDO010000010.1)开放阅读框长387 bp，编码128个氨基酸，分子量为14.72 kD，等电点7.52, 不含信号肽；CpunOBP4(GenBank登录号: GEDO010000011.1)开放阅读框长438 bp，编码145个氨基酸，在N端前30个氨基酸组成信号肽，去除信号肽后的序列长度为348 bp，分子量为12.82 kD，等电点6.58(图1)。另外，CpunOBP3和CpunOBP4均具有6个保守的半胱氨酸残基，与典型的气味结合蛋白家族特征X18-Cys1-X30-Cys2-X3-Cys3-X42-Cys4-X8-14-Cys5-X8-Cys6-X24-26(X代表任意氨基酸)一致，说明CpunOBP3与CpunOBP4在结构上属于OBPs家族。

图1 桃蛀螟CpunOBP3和CpunOBP4基因(去除信号肽序列) cDNA全长克隆Fig. 1 Cloning of the full-length cDNA sequences ofCpunOBP3 and CpunOBP4 genes (without signalpeptide sequence) of Conogethes punctiferalisM: DL2000 DNA marker.

2.2 桃蛀螟CpunOBP3和CpunOBP4的序列比对与系统发育

将桃蛀螟CpunOBP3和CpunOBP4的氨基酸序列与夜蛾科的棉铃虫以及草螟科6种昆虫的50个气味结合蛋白通过DNAMAN 7.0进行多序列比对，发现桃蛀螟CpunOBP3和CpunOBP4氨基酸序列中均有6个保守的半胱氨酸位点。通过对氨基酸的同源性和多态性进行分析，可以看出CpunOBP3与亚洲玉米螟的OfurOBP8和稻纵卷叶螟Cnaphalocrocismedinalis的CmedOBP1聚为一支，支持率为100%；CpunOBP4与亚洲玉米螟的OfurOBP16聚为一支，支持率为67%；表明它们之间的亲缘关系较近(图2)。

图2 邻接法构建的基于氨基酸序列的桃蛀螟与其他昆虫OBPs的系统发育树(1 000次重复)Fig. 2 Phylogenetic tree of OBPs from Conogethes punctiferalis and other insects by neighbor-joining methodbased on amino acid sequences (1 000 replicates)蛋白来源物种及其GenBank登录号Origin species of proteins and their GenBank accession numbers: 二化螟Chilo suppressalis (CsupGOBP1: ACJ07129.1; CsupOBP: AGM38605.1; CsupGOBP2: ACJ07120.1; CsupOBP5: AGK24581.1; CsupOBP4: AGK24580.1; CsupOBP3: AGK24579.1; CsupOBP2: AGK24578.1; CsupPBP1: ADK66921.1; CsupPBP2: ACJ07123.1; CsupPBP3: ADL09140.1); 桃蛀螟Conogethes punctiferalis (CpunOBP3; CpunOBP4); 棉铃虫Helicoverpa armigera (HarmOBP2: AEB54586.1; HarmOBP17: AFI57166.1; HarmGOBP1: AAL09821.1; HarmOBP31: ASA40067.1; HarmGOBP2: CAC08211.1; HarmOBP: AEX07279.1); 稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis (CmedGOBP2: AFG72997.1; CmedOBP1: AFG72998.1; CmedGOBP1: AFG72996.1; CmedPBP2: AGI37364.1; CmedPBP1: AFG72999.1; CmedOBP13: ALT31643.1; CmedOBP26: APY22693.1; CmedOBP2: AFG73000.1; CmedGOBP3: AGI37362.1); 脐橙螟Amyelois transitella (AtraPBP1: ACX47890.1; AtraGOBP2: ACX47894.1; AtraGOBP1: ACX47893.1); 欧洲玉米螟Ostrinia nubilalis (OnubPBP5: ADT78499.1; OnubPBP3: ADT78492.1; OnubPBP2: ADT78496.1; OnubPBP1: ADT78491.1; OnubPBP4: ADT78493.1; OnubGOBP2: BBB15978.1; OnubGOBP1: BBB15959.1); 亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis (OfurPBP4: ADT78503.1; OfurPBP5: ADT78504.1; OfurPBP3: ADT78502.1; OfurPBP2: ADT78501.1; OfurPBP1: ADT78500.1; OfurOBP14: BAV56801.1; OfurOBP15: BAV56802.1; OfurOBP16: BAV56803.1; OfurOBP17: BAV56804.1; OfurOBP12: BAV56799.1; OfurOBP11: BAV56798.1; OfurOBP9: BAV56796.1; OfurOBP4: BAV56791.1; OfurOBP5: BAV56792.1; OfurOBP6: BAV56793.1; OfurOBP7: BAV56794.1; OfurOBP8: BAV56795.1; OfurOBP3: BAV56790.1; OfurOBP2: BAV56789.1; OfurOBP1: BAV56788.1); 瓜绢野螟Diaphania indica (DindPBP: BAG71419.1).

2.3 桃蛀螟CpunOBP3和CpunOBP4的原核表达与纯化

对构建的原核表达载体 pET-30a/CpunOBP3和pET-30a/CpunOBP4进行双酶切和菌液PCR鉴定，结果显示酶切产物大小以及PCR产物条带大小均与预期的CpunOBP3和CpunOBP4目的片段大小相近，说明表达载体构建成功。随后分别对pET-30a/CpunOBP3和pET-30a/CpunOBP4菌液进行诱导表达，并利用15% SDS-PAGE电泳检测不同时间段CpunOBP3和CpunOBP4蛋白诱导表达效果，发现诱导表达所产生的CpunOBP3和CpunOBP4条带随诱导时间推移逐渐变宽，在6 h时表达量最多。并且SDS-PAGE电泳显示CpunOBP3和CpunOBP4重组蛋白主要以包涵体蛋白形式表达。所以经过蛋白纯化过程中的尿素变性、纯化及透析复性后用重组肠激酶去除His-tag标签，对去除标签后的目的蛋白再次纯化得到目的蛋白。经15% SDS-PAGE电泳检测，切除His-tag标签后的CpunOBP3及CpunOBP4(去除信号肽)目的蛋白条带分别约为14.72和12.82 kD(图3)。

图3 重组表达蛋白CpunOBP3和CpunOBP4的SDS-PAGE分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of the recombinant expression proteins CpunOBP3 and CpunOBP4M: 蛋白标准分子量Protein molecular weight marker; A: IPTG诱导不同时间下CpunOBP3表达量CpunOBP3 expression levels at different time after IPTG induction; B: IPTG诱导不同时间下CpunOBP4表达量CpunOBP4 expression levels at different time after IPTG induction; C: 不同分流液中CpunOBP3的表达CpunOBP3 expression in different separating media; D: 不同分流液中CpunOBP4的表达CpunOBP4 expression in different separating media. 0: 未经IPTG诱导的pET-30a/CpunOBP3表达产物 Expression product of pET-30a/CpunOBP3 non-induced by IPTG; 1-6: 分别经IPTG诱导1, 2, 3, 4, 5和6 h的pET-30a/CpunOBPs表达产物 Expression products of pET-30a/CpunOBPs induced by IPTG for 1, 2, 3, 4, 5, and 6 h, respectively. a: pET-30a/CpunOBP3菌液经超声破碎后的上清Supernatant of bacteria liquid of pET-30a/CpunOBP3 after sonication; b: 经超声破碎后的pET-30a/CpunOBP3全菌液Total bacteria liquid of pET-30a/CpunOBP3 after sonication; c: 上柱后的pET-30a/CpunOBP3蛋白流穿液Protein fluid of pET-30a/CpunOBP3 after flowing through the column; d: 纯化后的CpunOBP3蛋白 Purified CpunOBP3 protein; e: 重组肠激酶切除His-tag标签后的CpunOBP3蛋白Purified CpunOBP3 with His-tag removed by recombinant enterokinase; h, i: 经超声破碎后的pET-30a/CpunOBP4菌液沉淀Pellet of bacteria liquid of pET-30a/CpunOBP4 after sonication; j: pET-30a/CpunOBP4上柱后的蛋白流穿液Protein fluid of pET-30a/CpunOBP4 after flowing through the column; k: 纯化后的CpunOBP4蛋白 Purified CpunOBP4 protein; l: 重组肠激酶切除His-tag标签后的CpunOBP4蛋白Purified CpunOBP4 with His-tag removed by recombinant enterokinase. 箭头指示目的条带。Arrows indicate the target bands.

2.4 重组蛋白CpunOBP3和CpunOBP4与配体的结合特性

根据Scatchard方程绘制回归直线，计算得到CpunOBP3和CpunOBP4与1-NPN的解离常数Ki值分别为1.87 μmo1/L和2.23 μmo1/L(图4: A, B)。通过荧光竞争结合实验测定了重组蛋白CpunOBP3和CpunOBP4分别与2种桃蛀螟性信息素以及22种植物挥发物的结合能力。结果表明，CpunOBP3可以与测定的7种植物挥发物相结合，但不能与测试的2种桃蛀螟性信息素相结合；其中，与3-蒈烯的结合能力最强，解离常数Ki值为10.33 μmol/L；与其他6种植物挥发物的结合能力依次为莰烯(Ki=11.45 μmol/L)、α-水芹烯(Ki=12.65 μmol/L)、2-甲基丁醇(Ki=13.74 μmol/L)、2-甲基丁酸乙酯(Ki=18.21 μmol/L)、反-4-葵烯酸乙酯(Ki=19.84 μmol/L)以及α-法尼烯(Ki=23.34 μmol/L)(图5: A, B; 表2)。CpunOBP4不仅能与桃蛀螟2种性信息素十六醛(Ki=7.83 μmol/L)和顺-10-十六碳烯醛(Ki=14.65 μmol/L)结合，还能与8种植物挥发物结合，结合能力从大到小依次为丁酸乙酯、2-甲基丁醇、苯乙烯、桧烯、反-4-葵烯酸乙酯、3-蒈烯、γ-松油烯和α-法尼烯，Ki值分别为4.32, 8.65, 12.31, 14.53, 15.75, 16.04, 18.94和19.73 μmol/L(图5: C, D; 表2)。

图4 重组蛋白CpunOBP3(A)和CpunOBP4(B)与1-NPN的结合曲线Fig. 4 Binding curves of the recombinant CpunOBP3 (A) and CpunOBP4 (B) with 1-NPN

3 讨论

本研究基于桃蛀螟成虫触角转录组测序结果，利用PCR技术成功克隆了桃蛀螟两个气味结合蛋白基因CpunOBP3和CpunOBP4，并利用荧光竞争结合实验测定了表达纯化的重组蛋白CpunOBP3和CpunOBP4与24种配体(包括2种桃蛀螟性信息素和22种植物挥发物)的结合特性。结果表明，CpunOBP3和CpunOBP4都具有6个保守的半胱氨酸残基，是典型的OBPs结构(C1-X25-30-C2-X3-C3-X36-42-C4-X8-14-C5-X8-C6)，符合Xu等(2009)鉴别鳞翅目昆虫OBPs的经典模式。经信号肽预测发现CpunOBP4 N端有信号肽，而CpunOBP3 N端无信号肽，这种N端无信号肽的现象在其他昆虫中也有发现，如小菜蛾的PxylOBP13基因、棉铃虫的HarmGOBP1基因以及梨小食心虫Grapholitamolesta的GmolOBP3基因氨基酸序列的N端均不存在信号肽序列(Zhangetal., 2011; 宋月芹等, 2014; 覃江梅等, 2016)。

氨基酸序列比对及系统发育关系表明，CpunOBP3和CpunOBP4与亚洲玉米螟的气味结合蛋白同源性较高，位于同一分支上(图2)。从分类地位来看，桃蛀螟与亚洲玉米螟均隶属于草螟科；就危害特性而言，两者均以幼虫钻蛀危害玉米雌穗(Lietal., 2015; Lietal., 2020)。本研究结果从一定程度上暗示两种昆虫的气味结合蛋白在识别寄主植物过程中起着相似的化学感受作用。

为进一步了解这两个气味结合蛋白的生理功能，我们测定了其重组蛋白与多种挥发性气味物质的结合能力，结果发现桃蛀螟CpunOBP3和CpunOBP4与配体的结合特性存在明显差异(图5； 表2)。这种差异首先表现在两者与不同气味的选择性结合上，如：CpunOBP3只能与莰烯等7种植物挥发物相结合，而CpunOBP4既能与桃蛀螟性信息素(十六醛和顺-10-十六碳烯醛)结合，也能与植物挥发物(桧烯、丁酸乙酯等8种化合物)相结合。结果也说明，普通气味结合蛋白主要与寄主植物挥发物结合(Venthur and Zhou, 2018)，但也可以与性信息素结合，如梨小食心虫等昆虫的OBPs能显著结合其性信息素(Chenetal., 2018; Jingetal., 2019)。我们前期研究也表明，CpunOBP3在雌、雄蛾触角中的表达量差异不大，而CpunOBP4则主要在雄蛾触角中表达(Jiaetal., 2016)，这也进一步解释和说明了CpunOBP4可能在桃蛀螟雄蛾寻找配偶的过程中发挥重要作用。其次，CpunOBP3和CpunOBP4与配体结合特性的差异还表现在两者对相同气味物质的结合能力有所不同，如：CpunOBP3和CpunOBP4均能与3-蒈烯结合，但解离常数却相差很大，分别为10.33 μmol/L与16.04 μmol/L。因此，本研究结果也说明，一种气味物质并不仅仅由一种气味结合蛋白负责识别，同时一种气味结合蛋白也不是只负责一种气味化合物的识别与运输，这与之前有关小菜蛾和二化螟Chilosuppressalis等昆虫OBPs与气味分子结合功能的研究结果(Zhuetal., 2016; Khuhroetal., 2017)一致。这些研究表明，昆虫不同的OBPs可以协同互作，通过与寄主植物、昆虫性信息素等挥发物特异性识别，来共同调节昆虫取食、寄主选择以及交配产卵等行为(Britoetal., 2016)。综上，我们推测CpunOBP3仅在桃蛀螟定位寄主植物的过程中发挥作用，而CpunOBP4在寻找配偶和定位寄主植物的过程中均发挥重要作用。本研究的结果为进一步开展以桃蛀螟气味结合蛋白为靶标的绿色防控措施的靶点选择提供了科学参考。