组蛋白H3Ser10磷酸化在家蚕精母细胞减数分裂中的动态分布

张 冰, 邱 礽, 阚云超

(南阳师范学院, 河南省伏牛山昆虫生物学重点实验室, 昆虫生物反应器河南省工程实验室,中英南阳洛桑昆虫生物学联合实验室, 河南南阳 473061)

作为遗传物质的载体，大部分的DNA分子在细胞内与组蛋白一起组装为核小体，核小体高度螺旋缠绕为20 nm染色质丝，染色质丝再凝聚为光镜下肉眼可见的染色体。在细胞生命周期中，遗传物质就在染色体上随着其凝聚、分离和解凝聚而稳定传递。伴随着染色体状态变化的是组蛋白分子上存在的一系列修饰，这些修饰对于染色体的凝缩、姐妹染色单体之间的黏连以及异染色质的形成都非常重要(Hendzeletal., 1997; Weietal., 1999; Kaszas and Cande, 2000; Fischleetal., 2005; Hirotaetal., 2005)。

真核生物的组蛋白分子包括核心组蛋白H2A, H2B, H3和H4以及连接组蛋白H1，目前关于组蛋白修饰的研究多集中在组蛋白H3上。组蛋白H3在不同物种中都比较保守，同时，一些位点的表观修饰也相当保守。例如与转录活性相关的H3K4甲基化修饰(Vallianatos and Iwase, 2015)，与异染色质沉默相关的H3K9和H3K27的甲基化修饰(Black and Whetstine, 2011)，以及与染色质结构与功能相关的组蛋白磷酸化修饰如H3Ser10ph, H3T3ph和H3T11ph等。虽然这些修饰在很多物种中都比较保守，但是功能却不尽相同。例如，在四膜虫和哺乳动物细胞中组蛋白H3Ser10磷酸化(H3Ser10ph)伴随着染色质的浓缩，当第10位的丝氨酸突变为甘氨酸时，染色质的浓缩发生异常(Hendzeletal., 1997; Van Hooseretal., 1998)。然而玉米中H3Ser10ph则是与染色体之间的黏连相关(Kaszas and Cande, 2000)。 具有弥散型着丝粒的昆虫细胞中H3Ser10ph和染色质的凝缩有关(王姣玲等, 2017)，H3T3ph则与胞质分裂相关(张冰等, 2018)，说明同样的修饰在不同物种中可能发生了功能分化。

减数分裂是生殖细胞形成单倍性配子的分裂方式。生殖细胞进行减数分裂时，遗传物质只复制一次，细胞连续分裂两次，最终形成染色体数目减半的配子。减数分裂周期可以分为间期和分裂期，间期包括G1, S和G2期。分裂期则由减数第一次分裂(meiosis I)和减数第二次分裂(meiosis II)组成。减数第一次分裂分为前期I、中期I、后期I和末期I。其中前期I持续时间较长，根据这个时期染色体的形态变化又将其分为细线期、偶线期、粗线期、双线期和终变期5个阶段(Hillersetal., 2017)。第二次减数分裂与有丝分裂非常相似，包括前期II、中期II、后期II、末期II和胞质分裂II等几个过程。最终形成染色体数目减半的4个配子。鳞翅目昆虫精子发育过程中分化产生两种类型的精子：有核精子和无核精子。有核精子直接与卵细胞结合形成受精卵，无核精子则辅助有核精子与卵细胞的结合。已有的研究表明产生无核精子与有核精子的减数分裂事件存在显著差异，无核精子精母细胞延迟进入前期I并且在后期产生大量错分离的染色体，有核精子精母细胞则进行正常的减数分裂过程 (Friedländeretal., 2005)。已知H3Ser10ph在昆虫有丝分裂中参与染色质的凝缩，但是它在家蚕Bombyxmori有核精子和无核精子精母细胞减数分裂中的生物学作用尚不明确。本研究使用特异性抗组蛋白H3Ser10磷酸化的抗体，以4龄幼虫至蛹期家蚕为实验材料，应用免疫荧光技术对家蚕精母细胞减数分裂过程中组蛋白H3 Ser10磷酸化在细胞周期中的动态分布进行研究，为探究家蚕有核精子和无核精子精母细胞减数分裂提供基础。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫及饲养

供试家蚕为大造P50品种,采用新鲜桑叶饲养，饲养温度25±3℃，相对湿度60%±10%，光周期12L∶12D。解剖4龄幼虫至蛹期家蚕个体，收集不同时期的精巢组织暂存于1×PBS缓冲液中。

1.2 供试抗体

H3Ser10ph抗体RB7279(P-Ab)由上海吉尔生化有限公司制备(王姣玲等, 2017)；抗组蛋白H3抗体ab1791购自Abcam公司;Tubulin抗体(Anti-Alpha Tubulin Mouse Monoclonal, 66031-1-Ig)购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.3 精巢组织蛋白提取和Western blot检测H3Ser10ph在精巢中的定位

收集1.1节50头雄蚕个体的精巢组织，利用蛋白提取试剂盒(KGP150, KeyGEN BioTECH)进行核蛋白和胞浆蛋白提取。对提取所得蛋白进行SDS-PAGE电泳检测，转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入H3Ser10ph抗体或抗组蛋白H3内参抗体(1∶500稀释, v/v)4℃孵育过夜。二抗使用HRP标记的羊抗兔IgG(1∶2 000稀释, v/v)，室温振荡孵育1 h，以ECL化学发光试剂盒(NCI4106, SHHY)显色之后凝胶成像系统拍照。

1.4 免疫荧光标记分析H3Ser10ph在精母细胞减数分裂染色体上的定位

将3个不同时期的精巢组织放入同一张加有10 μL 1×PBS的多聚赖氨酸载玻片上，用镊子压碎，将碎片夹走，再补充2～3 μL 1×PBS溶液，加5 μL活化的聚丙烯酰胺溶液：100 μL 15% PAGE, 5 μL 20%过硫酸铵(w/v), 5 μL 20%亚硫酸钠(w/v)，迅速混匀，盖上薄盖玻片(18 mm×18 mm)。待胶凝聚之后，取下盖玻片，将载玻片置于1×PBS中洗两次，4%多聚甲醛室温固定30 min，1×PBS漂洗3次，0.25% Triton X-100透化2 h，1×PBS漂洗3次，3%牛血清蛋白(BSA)室温封闭1 h，1×PBS漂洗3次。H3Ser10ph抗体(1∶200稀释, v/v)和Tubulin抗体(1∶1 000稀释, v/v)混合后，4℃孵育过夜。Alexa FluorR 594标记的羊抗兔IgG(Goat Anti-Rabbit IgG, Jackson ImmunoResearch)(1∶2 000, v/v)和FITC标记的羊抗鼠IgG(Goat Anti-Mouse IgG, Jackson ImmunoResearch)(1∶2 000, v/v)，37℃孵育2 h。最后用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI, 0.01 mg/mL+90%甘油)封片固定。利用ZEISS激光扫描共聚焦显微镜观察荧光信号。

2 结果

2.1 组蛋白H3Ser10ph抗体的特异性分析

对精巢组织所提取的胞浆蛋白和核蛋白(图1: A)进行H3Ser10ph抗体特异性检测，Western blot结果显示在与H3组蛋白分子量相近的17 kD处有一条单一的目的条带(图1: B)，表明所使用的抗体可以特异识别家蚕精巢组织中的H3组蛋白，可以作为进一步减数分裂细胞周期定位的抗体进行免疫检测。

图1 Western blot检测家蚕精巢组织中H3Ser10磷酸化(H3Ser10ph)抗体的特异性Fig. 1 The specificity of the phospholated H3 Ser10(H3Ser10ph) antibody in testes of Bombyx moridetected by Western blotA: SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳之后通过考马斯亮蓝染色检测提取的精巢组织胞浆蛋白(Cy)和核蛋白(N)Detection of cytoplasmic (Cy) and nuclear protein (N) extracted from testes by Coomassie blue staining after SDS-polyacrylamide gel electrophoresis; B: Western blot检测精巢组织所提取的胞浆蛋白(Cy)和核蛋白(N)中H3Ser10ph抗体(P-Ab)，组蛋白H3抗体(ab1791)为内参抗体Detection of the H3Ser10ph antibody (P-Ab) in cytoplasmic (Cy) and nuclear protein (N) extracted from testes by Western blot, and the histone H3 antibody (ab1791) is the internal control antibody. MW: 蛋白质分子量标准Protein molecular weight marker.

2.2 H3Ser10ph在有核精子精母细胞减数分裂中的动态分布

对家蚕有核精子精母细胞减数分裂中H3Ser10ph的定位进行观察，免疫荧光的结果表明：在有核精子精母细胞进入减数第一次分裂前期I的粗线期时即可观察到H3Ser10ph信号定位在染色体的特定位置(图2: A)，随着细胞进入双线期，染色体上的信号逐渐变弱(图2: B)，至终变期，信号几乎完全消失(图2: C)；当细胞进入中期I时，染色体上又开始出现红色信号(图2: D)，而且随着第一次减数分裂周期继续进行，染色体上的信号逐渐变多变强，整条染色体上均可以观察到磷酸化信号，不同位置的信号强弱基本一致(图2: E)；后期I和末期I时染色体上的信号消失。当细胞进入减数第二次分裂前中期时，染色体臂上的信号消失，在靠近纺锤体微管的分裂面处有弥散的H3Ser10ph抗体的信号(图2: F, H)；减数第二次分裂末期，仅剩余非常微弱的H3Ser10ph信号残留于染色体的特定位置(图2: G)。

图2 组蛋白H3Ser10磷酸化(H3Ser10ph)抗体在家蚕有核精子精母细胞的定位Fig. 2 Localization of the phosphorylated histone H3Ser10 (H3Ser10ph) antibodyduring eupyrene spermatocytes of the silkworm, Bombyx moriA: 粗线期，H3Ser10ph抗体的信号出现在染色体的一些区域At the pachytene, the H3Ser10ph antibody signals appear in some regions of chromosome; B: 双线期，H3Ser10ph抗体的红色荧光信号变弱 At the diplotene, the red fluorescent signals of the H3Ser10ph antibody become faint; C: 终变期，H3Ser10ph抗体的信号完全消失 At the diakinesis, the H3Ser10ph antibody signals completely disappear; D: 中期I，染色体上又开始出现一些较强的H3Ser10ph抗体的信号 At the metaphase I, some of strong fluorescent staining signals of H3Ser10ph are localized on the chromosome; E: 中期I，H3Ser10ph抗体的信号在整条染色体上分布At the metaphase I, the H3Ser10ph antibody signals spread along the whole chromosomes; F: 前中期II，在靠近微管的分裂面处有弥散的H3Ser10ph抗体的信号，如放大图H中箭头所示At the metaphase II, there is holo-shaped fluorescent signal of the H3Ser10ph near the microtubulin attaching side, as shown by the arrows in enlarged view H; G: 末期II，仅剩余非常微弱的H3Ser10ph抗体的信号，蓝色信号示DAPI，红色示H3Ser10ph抗体的信号, 绿色示α-微管蛋白。At the telophase II, there are very weak staining signals of the H3Ser10ph antibody. DAPI is indicated with blue signal, the H3Ser10ph antibody with red, and α-tubulin with green. 标尺Bars=10 μm.

2.3 H3Ser10ph在无核精子精母细胞减数分裂中的动态分布

对家蚕无核精子精母细胞减数分裂中H3Ser10ph的定位进行观察，免疫荧光的结果表明：与有核精子精母细胞中的H3Ser10ph信号相似，在无核精子精母细胞减数分裂粗线期可观察到信号定位在染色体的特定位置(图3: A)，随着细胞进入第一次减数分裂中期I时，染色体上的信号逐渐变多变强，整条染色体上均可以观察到磷酸化信号，不同位置的信号强弱基本一致(图3: B)。不同的是，后期I，伴随着纺锤丝将同源染色体拉向两极，H3Ser10ph的信号依然均匀分布在染色体上(图3: C)；而且与有核精子精母细胞纺锤体与同源染色体结合不同，在无核精母细胞后期I时，纺锤丝微管与赤道面平行排列。当细胞进入末期I时，分离到两端的染色体上依然存在H3Ser10ph抗体的信号(图3: D)，减数第二次分裂中期，染色体臂上的信号消失，在靠近纺锤体微管的分裂面处有弥散的H3Ser10ph抗体的信号(图3: E)。

图3 组蛋白H3Ser10磷酸化(H3Ser10ph)抗体在家蚕无核精子精母细胞的定位Fig. 3 Localization of the phosphorylated histone H3Ser10 (H3Ser10ph) antibodyduring apyrene spermatocytes of the silkworm, Bombyx moriA: 粗线期，H3Ser10ph抗体的信号出现在染色体的一些区域At the pachytene, the H3Ser10ph antibody signals appear in some regions of chromosome; B: 中期I，H3Ser10ph抗体的信号在整条染色体上分布 At the metaphase I, the H3Ser10ph antibody signals spread along the whole chromosomes; C: 后期I，H3Ser10ph抗体的信号依然存在于整条染色体上At the anaphase I, the H3Ser10ph antibody signals spread along the whole chromosomes; D: 末期I，分离到两端的染色体上依然存在较强的H3Ser10ph抗体的信号At the anaphase I, strong fluorescent staining signals of the H3Ser10ph antibody are still localized on the chromosome separated to both ends; E: 中期II，在靠近微管的分裂面处有弥散的H3Ser10ph抗体的信号 At the metaphase II, there is holo-shaped fluorescent signal of the H3Ser10ph antibody close to the microtubulin attaching side. 蓝色信号示DAPI，红色示H3Ser10ph抗体的信号, 绿色示α-微管蛋白。DAPI is indicated with blue signal, the H3Ser10ph antibody with red, and α-tubulin with green. 标尺Bars=10 μm.

3 讨论

减数分裂中DNA复制一次，而细胞连续分裂两次，为了保证染色体的正确分离，细胞中存在许多精确的调控机制。其中，DNA复制之后定位在染色体上的黏连蛋白从染色体上的逐步降解对于染色体的正确分离至关重要(Hirano, 2000)。减I后期，姐妹染色单体臂上的黏连蛋白在CK1激酶的作用下被降解，而着丝粒区的黏连蛋白则在一种被称为SHUGOSHIN蛋白的保护下直到减II后期才会被降解(Ishiguroetal., 2010)，在着丝粒区残留的黏连蛋白对于动粒蛋白与纺锤丝微管之间的张力维持很重要。SGO1在染色体上的重分布对于染色体的正确分离很关键(Liuetal., 2013)。

家蚕作为鳞翅目的模式物种，它所拥有的弥散型着丝粒染色体既丢失了着丝粒区表观蛋白CENH3，又丢失了动力蛋白CENPA和CENPC(Drinnenbergetal., 2014)，暗示在家蚕中可能有不依赖于这些蛋白的动粒组装模式。最近的研究表明CENP-T(Cortes-Silvaetal., 2020)和CENP-N(Lietal., 2019)在家蚕不依赖CENH3的动粒组装中发挥重要作用。对家蚕有核精子和无核精子精母细胞的研究发现，与有核精子精母细胞中心粒周期性地与核膜结合不同，无核精子精母细胞明显缺乏中心粒与细胞核的附着(Yamashiki and Kawamura, 1998)。舞毒蛾精母细胞细胞学的研究结果表明无核精子精母细胞在前期I同源染色体不完全配对联会，存在单价体，核仁不融合，后期I染色体分离异常(Reinholdtetal., 2002)。

本研究利用特异识别H3Ser10ph抗体，在家蚕精巢组织中利用免疫荧光技术，研究了这一保守的组蛋白翻译后修饰在家蚕有核精子和无核精子精母细胞减数分裂中的动态分布(图2和3)。结果表明，粗线期H3Ser10ph修饰在两种类型的精母细胞中均出现点状信号，至中期I，高度凝缩的染色体上均匀分布较强的信号；不同的是，在无核精子精母细胞后期I至末期I时持续在染色体上存在均一的信号，与染色体持续凝缩的状态相一致，而且后期I时纺锤丝与赤道面平行而不是垂直(图3: C)，说明H3Ser10ph可能参与家蚕有核精子和无核精子精母细胞减数分裂后期I至末期I的调控，暗示减I存在异常分离的无核精子精母细胞染色质去凝缩也出现异常。结合H3Ser10ph修饰在草地贪夜蛾Sf9细胞有丝分裂中参与染色质凝缩的功能，推测该修饰在鳞翅目的弥散型着丝粒染色体上参与染色质凝缩与去凝缩的调控。未来可以通过克隆家蚕中催化组蛋白磷酸化修饰的相关蛋白激酶进行深入的功能研究。该结果为进一步探讨组蛋白翻译后修饰在家蚕精母细胞减数分裂中的功能提供了前期基础。