Ⅰ群禽腺病毒分离鉴定及penton基因序列分析

王彩先 陆冰洋 刘华栋 李婷婷 唐娟 丁树荣

摘要：为调查山西省Ⅰ群禽腺病毒感染状况，2018—2020年从山西各地区鸡场采集样品204份，通过SPF鸡胚传代增殖，设计检测引物及penton基因全序列引物，经PCR鉴定，选取阳性毒株进行免疫琼脂扩散试验、致细胞病变和鸡胚致病性试验。结果显示：60份为Ⅰ群禽腺病毒阳性，阳性率为29.4%（60/204），从60份阳性Ⅰ群禽腺病毒中选取8株病毒与Ⅰ群禽腺病毒阳性血清反应，均呈现阳性；并且都可以导致鸡胚肝细胞发生形态变化，增强其折光性；鸡胚试验可致鸡胚发育不良或致死，有明显病变发生。将克隆的8株penton基因进行序列分析比对及遗传进化分析，显示与Ⅰ群禽腺病毒血清1型和血清4型亲缘关系最近，同源性高达99.6%～100%，其中6株为血清1型，2株为血清4型；与Ⅰ群禽腺病毒其它血清型同源性达72.0%～75.8%，与Ⅱ群禽腺病毒和Ⅲ群禽腺病毒同源性为49.0%～52.8%。研究提示，Ⅰ群禽腺病毒普遍存在于养殖群体中，应当加强对Ⅰ群禽腺病毒的检测和免疫，防治其它传染病的继发感染，以提高动物生产的安全。

关键词：Ⅰ群禽腺病毒；分离鉴定；penton基因

禽腺病毒（fowl adenovirus，FAdV）归属于腺病毒科腺病毒属，Ⅰ群禽腺病毒为线状双链DNA病毒[1-3]，具有共同的抗原，禽腺病毒颗粒呈球形，具有12个定点，直径为70～90nm，無囊膜，呈20面体对称结构，由纤突（faber）、芯髓（cora）、衣壳（capsid）及相关蛋白构成表面的252个壳粒，壳粒可以分成六邻体（hexon）、五邻体（penton），每个五邻体连接两根纤毛（fiber-1、fiber-2）[4-9]。其中penton所在的头节区能够识别细胞表面的病毒受体，在病毒入侵细胞的过程中起着非常重要的作用[10]。Ⅰ群禽腺病毒包括传统的禽腺病毒及其他禽类分离物，可以水平传播、垂直传播、污染鸡胚。该病多数呈隐性感染，在动物体内复制不发病，当动物抵抗力降低时随同其他疾病共同发病，且影响动物免疫功能。近年出现其他Ⅰ群禽腺病毒具有强致病性，死亡率可达60%[11-13]。

本试验对采集样品进行免疫琼脂扩散试验、血凝试验、致细胞病变和鸡胚致病性试验及PCR检测，对病毒penton基因序列进行分析比对。根据该基因建立起来的PCR诊断方法可用于Ⅰ群禽腺病毒的鉴定。

1材料与方法

1.1材料及试验动物

SPF鸡胚，购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司，雏鸡均由SPF鸡胚孵化；Ⅰ群禽腺病毒、减蛋综合征（EDSV）、新城疫病毒（NDV）、禽传染性支气管炎病毒（IBV）、禽流感H9亚型（AIV-H9）、禽传染性喉气管炎病毒（ILTV）阳性血清和SPF鸡阴性血清由山西农业大学动物医学学院提供。

1.2主要试剂

E.coli DH5α菌株、病毒基因组DNA抽提试剂盒、PCR产物纯化回收试剂盒、DMEM、胎牛血清，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；pMD18-T克隆载体、Premix Taq，购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.3病毒的分离

取采集样品，60Hz、10min研磨，反复冻融3次后，6，000r/min离心5min，取上清液过0.22μm滤菌器。采用尿囊腔接种法接种于9～10日龄SPF鸡胚，每枚SPF鸡胚接种200μL，弃24h内死亡鸡胚，温育120h，将全部SPF鸡胚放入4℃、6h，收获尿囊液，连续3次传代后收集的尿囊液用于DNA提取，提取方法参照病毒基因组DNA提取试剂盒说明书进行。

1.4引物设计

根据GeneBank公布的FAdV-4中hexon和penton基因序列[14，15]，设计hexon检测引物，分别是text-F/text-R，预期片段大小为421bp；设计penton的测序引物，分别是penton-1F/penton-1R，预期片段大小为1，834bp，penton-4F/penton-4R，预期片段大小为1，759bp，引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。

1.5样品PCR检测

PCR扩增体系（总体积为25μL）：Premix Taq 20μL，DNA模板3μL，text-F/text-R各1μL。PCR扩增程序：95℃预变性10min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃再延伸10min。取5μL PCR反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.6 penton基因的克隆

1.5中PCR检测为禽腺病毒阳性的毒株中，选取8株进行PCR，扩增体系（总体积为25μL）：Premix Taq 20μL，DNA模板3μL，上下游引物各1μL。PCR扩增程序：95℃预变性10min；95℃变性 30s，55℃/56℃退火 30s，72℃延伸 30s，共 30 个循环；72℃再延伸 10min。取 5μ L PCR 反应产物经 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。PCR 产物经胶回收，将胶回收产物连接 pMD18-T 克隆载体，将连接产物转化入大肠杆菌DH 5α ，经 37℃培养 24h 后，挑取单菌落，经 PCR 鉴定，阳性菌送北京六合华大基因科技有限公司进行基因测序，测序结果使用 DNAstar 进行序列比对，并构建进化树。

1.7 免疫琼脂扩散试验

经 1.5 中 PCR 鉴定为阳性的禽腺病毒毒株中，选取8 株不同年份的禽腺病毒毒株，制备抗原，按照常规方法进行琼脂扩散试验，用Ⅰ群禽腺病毒阳性血清与 8 株禽腺病毒抗原互相作用，Ⅰ群禽腺病毒阳性血清与减蛋综合征（EDSV）、新城疫病毒（NDV）、禽传染性支气管炎病毒（IBV）、禽流感 H9 亚型（AIV-H9）、禽传染性喉气管炎病毒（ILTV）阳性血清和 SPF 鸡阴性血清互相作用为对照

1.8 SPF鸡胚肝细胞制备及病变

按照制备原代鸡胚肝细胞方法将 15～16d SPF 鸡胚的肝组织用 0.25%胰酶消化，以含10%胎牛血清的DMEM作为培养基，放置在 CO2 培养箱中以 37℃，5%CO2 培养，经培养长成至单层后，取 2mL 分离上清液接种 SPF 鸡胚肝细胞，经2h 感染后弃去分离物，加入 20mL 5%胎牛血清维持液，同时设置未接种分离物SPF鸡胚肝细胞为阴性对照，12h 后观察培养情况，以后每3h 观察一次。

1.9 鸡胚致病性试验

8株禽腺病毒分离物上清液分别接种9～10d SPF鸡胚48枚，每株6枚，每枚SPF鸡胚接种200μL设置空白对照6枚。37℃孵育培养，分别于72h、96h、120h观察鸡胚的生长情况和病变情况。

2结果与分析

2.1样品PCR检测

经病毒基因组DNA提取试剂盒提取盲传3代增殖尿囊液的DNA，经PCR鉴定，在204份样品中，60份为Ⅰ群禽腺病毒阳性，阳性率为29.4%（60/204），部分样品的PCR结果见图1。

2.2 penton基因的克隆

分别以8株阳性禽腺病毒上清液提取的DNA为模板进行PCR扩增，均能扩增出1，736bp片段，与预期目标相符，阴性对照pMD-18T载体质粒中未能扩增出目标条带，PCR结果见图2。

2.3 penton基因的序列比较和进化树分析

使用DNAStar软件对8株1，759bp的penton基因序列进行分析。其中FAV-01和FAV-03与Ⅰ群禽腺病毒血清4型同源性分别为100%与99.8%，其余6株阳性禽腺病毒毒株与Ⅰ群禽腺病毒血清1型同源性为99.6%～99.9%，所有的8株阳性禽腺病毒毒株与Ⅰ群禽腺病毒其他血清型同源性为72.0%～75.8%，与Ⅱ群禽腺病毒HEV（Turkey adenovirus 3 strain CA-AB）的同源性为49.0%～50.4%，与Ⅲ群禽腺病毒EDSV（Duck adenovirus 1 strain D11-JW-012）的同源性为50.9%～52.8%，见图3。

遗传进化树分析显示，FAV-01与FAV-03与Ⅰ群禽腺病毒血清4型亲缘关系最近，其余6株阳性禽腺病毒毒株与Ⅰ群禽腺病毒血清1型亲缘关系最近，所有的8株阳性禽腺病毒毒株与Ⅰ群禽腺病毒其他血清型亲缘关系相对较远，与Ⅱ群禽腺病毒HEV和Ⅲ群禽腺病毒EDSV属于不同进化分支，亲缘关系最远，见图4。

2.4琼脂扩散试验结果

8株阳性禽腺病毒上清液与Ⅰ群禽腺病毒阳性血清均出现特异性白色沉淀带，而减蛋综合征（EDSV）、新城疫病毒（NDV）、禽传染性支气管炎病毒（IBV）、禽流感H9亚型（AIV-H9）、禽传染性喉气管炎病毒（ILTV）阳性血清和SPF鸡阴性血清均不能与Ⅰ群禽腺病毒阳性血清产生特异性白色沉淀带。

2.5细胞病变结果

8株阳性禽腺病毒上清液接种SPF鸡胚肝细胞，鸡胚肝细胞12h后逐渐开始出现变圆、皱缩，24h后集聚成堆、脱落、遮光性增强、细胞间距增大，呈拉网状结构的病变特征；而对照组的鸡胚肝细胞无相似病变特征。

2.6鸡胚致病性试验

8株阳性禽腺病毒上清液接种SPF鸡胚后72h无死亡产生，每株禽腺病毒4℃冷冻2枚，共计16枚可观察到全部SPF鸡胚均出现尿囊液浑浊，有大量尿酸盐产生，部分胚胎发育不良，呈侏儒胚，有出血症状，肝脏无明显病变，绒毛尿囊膜增厚，阴性对照胚体发育正常无病变；96h后无死亡产生，每株禽腺病毒4℃冷冻2枚，共计16枚，病变情况与72h相似，出血鸡胚组织松软，取出时容易撕开断裂；120h有1枚SPF鸡胚死亡，观察剩余16枚鸡胚，病变情况与72h相似，死亡鸡胚出现溶解样病变，肝脏呈土黄色无出血点。各阶段对照组SPF鸡胚均发育正常。

3讨论

Ⅰ群禽腺病毒对禽类的致病性主要引起的疾病有心包积液综合征（HPS）和包涵体肝炎（IBH）[16，17]，本试验从采集的204份样品中，经SPF鸡胚传代增殖及PCR鉴定，确定60份样品为Ⅰ群禽腺病毒阳性，阳性率为29.4%（60/204），可见Ⅰ群禽腺病毒普遍存在于健康鸡群中，呈现感染率较高，并且发病率低于感染率。Ⅰ群禽腺病毒感染鸡群通常没有明显的临床症状，并且可以垂直传播。但是根据Ⅰ群禽腺病毒毒力的不同也可引起包肝炎和心包积液综合征，主要临床表现为心包腔内充满大量黄色透明液体或胶胨状物质，肝脏肿大出血，脾脏肿大出血，肾脏肿大出血伴有尿酸盐沉积，腺胃和肌胃交界出血，偶有肺脏出血发生。

由于Ⅰ群禽腺病毒普遍存在于健康禽类之中[18]，如鸡、鸭、鹅等，却不表现明显的致病特征和临床症状，极易在养殖生产中被忽略，由于该病垂直传播，隐性污染鸡胚的可能性被提高，加之部分生物制品中仍无法完全使用SPF鸡胚或者是免疫鸡胚，在生产过程中依赖非免疫鸡胚，使得Ⅰ群禽腺病毒污染生物制品的情况发生，严重影响胚源生物制品的质量。

8株陽性Ⅰ群禽腺病毒毒株经序列同源性比较和进化树分析，penton基因与已报道的Ⅰ群禽腺病毒血清1型和血清4型序列同源性达99.6%～100%，与其他Ⅰ群禽腺病毒血清型同源性达72.0%～75.8%，与Ⅱ群禽腺病毒HEV同源性为49.0%～50.4%，与Ⅲ群禽腺病毒EDSV同源性为50.9%～52.8%；进化树分析确定8株阳性毒株其中6株阳性与Ⅰ群禽腺病毒血清1型接近，2株阳性与血清4型接近，8株阳性与Ⅰ群禽腺病毒其他血清型较远，而与Ⅱ群禽腺病毒和Ⅲ群禽腺病毒亲缘关系最远，属于不同的进化支，表明8株阳性毒株均归属于Ⅰ群禽腺病毒。

Ⅰ群禽腺病毒虽然只有少数血清型能够引起明显发病，但当鸡群受到其他禽类传染病的侵害时可以产生协同作用，如鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）和鸡传染性贫血病毒（CIAV）[19-21]，可使条件性致病源发生快速感染，导致免疫系统受到侵害，引起产蛋下降、再生障礙性贫血和死亡等症状，应当对Ⅰ群禽腺病毒予以重视，防止大规模疾病发生。

4结论

本试验分离到60株FAV，多数阳性毒株采集于无症状鸡群，表明FAV在鸡群中呈阴性感染状态，应当采取血清学检测或者是分子生物学检测，以指导鸡场采用疫苗或者淘汰的方法进行净化，经PCR鉴定及序列测定毒株仍未有更详尽的研究，将会对其进行更深入的探讨。█

参考文献：

[1]牛登云，沈元，王蕊，等.2015年我国Ⅰ群禽腺病毒分子流行病学调查[J].中国家禽，2016，38（9）：65-68.

[2] Adair B M， Fitzgerald S D. Group 1 adenovirus infections [J]. Diseases of poultry， 2008， 12： 251-266.

[3] Hess M. Aviadenovirus infections [J]. Diseases of poultry， 2013： 290-300.

[4] Fitzgerald S D， Rautenschlein S， Mahsoub H M， et al. Adenovirus infections[J]. Diseases of poultry， 2020： 321-363.

[5]徐丹.FAdV-4 pcDNA3.1-Penton重组质粒的构建及免疫原性的初步探究[D].沈阳农业大学，2019.

[6] Shah M S， Ashraf A， Khan M I， et al. Fowl adenovirus： history， emergence， biology and development of a vaccine against hydropericardium syndrome [J]. Archives of virology， 2017， 162 （7）： 1833-1843.

[7] Akopian T A， Lazareva S E， Tikhomirov E E， et al. Genes for fowl adenovirus CELO penton base and core polypeptides [J]. Archives of virology， 1996， 141（2）： 357-365.

[8] Park H S， Lim I S， Kim S K， et al. Molecular analysis of the hexon， penton base， and fiber-2 genes of Korean fowl adenovirus serotype 4 isolates from hydropericardium syndrome-affected chickens [J]. Virus Genes， 2017， 53（1）： 111-116.

[9]王馨培. 辽宁地区野禽 FAdV-4 感染的调查及其 Penton 基因序列分析[D].沈阳农业大学，2019.

[10] Liu Y， Wan W， Gao D， et al. Genetic characterization of novel fowl aviadenovirus 4 isolates from outbreaks of hepatitis-hydropericardium syndrome in broiler chickens in China [J]. Emerging microbes & infections， 2016， 5（1）： 1-8.

[11] 高辉，张梦荷，冯茹，等.Ⅰ群禽腺病毒 4 型 Penton 基因的克隆及原核表

达[J].动物医学进展，2018，39（5）：1-5.

[12] 程昊.2015-2017 年禽腺病毒的分离鉴定及分别表达禽腺病毒 penton和 fiber2 蛋白重组新城疫病毒的构建[D].扬州大学，2018.

[13] 张梦荷. Ⅰ群禽腺病毒血清 4 型 PCR 检测方法的建立及 Penton 蛋白的原核表达[D].西北农林科技大学，2018.

[14] Matczuk A K， Niczyporuk J S， Kuczkowski M， et al. Whole genome sequencing of Fowl aviadenovirus A-a causative agent of gizzard erosion and ulceration， in adult laying hens[J]. Infection， Genetics and Evolution， 2017， 48： 47-53.

[15] Vera-Herná ndez P F， Morales-Garzón A， Cortés-Espinosa D V， et al. Clinicopathological characterization and genomic sequence differences observed in a highly virulent fowl Aviadenovirus serotype 4[J]. Avian Pathology， 2016， 45（1）： 73-81.

[16] Hess M， Bl？cker H， Brandt P. The complete nucleotide sequence of the egg drop syndrome virus： an intermediate between mastadenoviruses and aviadenoviruses[J]. Virology， 1997， 238 （1）： 145-156.

[17] Jucker M T， McQuiston J R， Van Den Hurk J V， et al. Characterization of the haemorrhagic enteritis virus genome and the sequence of the putative penton base and core protein genes[J]. Journal of general virology， 1996， 77（3）： 469-479.

[18] Aziz F， Tufail S， Shah M A， et al. In silico epitope prediction and immunogenic analysis for penton base epitope-focused vaccine against hydropericardium syndrome in chicken [J]. Virus research， 2019， 273： 197750.

[19] Kim J I， Oh S J， Lee I， et al. Evolutionary relationships of the hexon and penton base genes of novel squirrel adenovirus [J]. Molecular phylogenetics and evolution， 2017， 116： 25-29.

[20] McCoy R J， Johnson M A， Studdert M J， et al. Genomic location and nucleotide sequence of a porcine adenovirus penton base gene[J]. Archives of virology， 1996， 141（7）： 1367-1375.

[21] Saif Y M， Barnes H， Glisson J R， et al. Diseases of poultry. 12th ed. Ames： Iowa State University Press， 2008： 289-329.