升气壮阳汤超声雾化法对变应性鼻炎小鼠的作用研究

高文英，金正龙，陈美娟，李 银，郑燕霞

(1. 广州中医药大学，广东 广州 510006；2. 江门市儿童医院，广东 江门 529000；3. 五邑中医院，广东 江门 529000；4. 广东省中医院，广东 广州 510006)

变应性鼻炎是一种由基因与环境互相作用而诱发的多因素疾病，以反复发作性鼻塞、鼻痒、喷嚏、流涕为主要症状，是变应原作用下经免疫学机制产生的一种鼻黏膜炎症[1]。该病发病率较高，儿童中发病率高达30%。目前西医多采用抗组胺药物、糖皮质激素、抗胆碱能制剂、肥大细胞稳定剂、白三烯抑制剂、抗IgE以及免疫疗法治疗[2-3]，虽然可改善症状，但停药后复发率较高，不良反应明显。而中药经方治疗变应性鼻炎具有明显优势，可降低复发率[4]。韩丽等[5]认为变应性鼻炎为先天禀赋不足，或后天失养，致肺脾肾亏虚，风、寒、异气等外邪引而发病，采用“冬病夏治”穴位敷贴法治疗以肺气虚与肾阳亏虚为主的患儿取得较好疗效。刘传珍等[6]采用中药超声雾化吸入治疗小儿过敏性鼻炎亦取得较好疗效。升气壮阳汤为广东省名中医、广东省中医院中医儿科主任许尤佳教授通过几十年临床经验所创，本研究通过小鼠变应性鼻炎模型，探究了升气壮阳汤超声雾化给药对变应性鼻炎的干预作用及可能作用机制，旨在为其临床应用提供更多依据。

1 实验材料与方法

1.1动物 SPF级BALB/c雌性小鼠40只，3周龄，体重8～12 g，由广州中医药大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK(粤)2019-0047。动物于江门市妇幼保健院动物实验室中饲养3 d，动物中心温度(22±2)℃，湿度(60±10)%。

1.2药物与试剂 升气壮阳汤组方(白术80 g、补骨脂100 g、防风50 g、升麻30 g、太子参60 g、陈皮20 g、石菖蒲50 g、芒果核150 g、川续断100 g、甘草30 g)由广东省中医院中药房提供，最终浓度为4.8 mg/mL。氯雷他定片购自拜耳医药(上海)有限公司，批号：20190214；免疫球蛋白E(IgE)、组胺、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-2(IL-2) 、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-10(IL-10)、γ-干扰素(IFN-γ)试剂盒均购自苏州卡尔文生物科技有限公司，批号依次为E20190510A、E20190417A、E20190521A、E20190511A、E20190506A、E20190513A、E20190505A；合成cDNA试剂盒、逆转录试剂盒、RT-PCR试剂盒购于北京康为世纪生物科技有限公司。

1.3仪器 高速冷冻离心机，湖南湘仪，型号：H2100R；BK-400全自动生化分析仪，山东博科科学仪器有限公司；7900HT实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-timePCR)仪，美国ABI公司；超声雾化仪，型号：JY-W52， 苏州索尼克超声科技有限公司。

1.4实验方法 随机选取10只小鼠作为空白组，其余小鼠依据陈晴等[7]方法制备变应性鼻炎模型：基础致敏时以0.3 mg卵清蛋白作为抗原，佐剂30 mg氢氧化铝粉末，加入0.9%氯化钠注射液1 mL制备为混悬液，进行腹腔注射，每次注射间隔1 d，共注射7次。腹腔注射第12天，两侧鼻腔中使用微量加样器每侧滴入含0.5%卵清蛋白的氯化钠溶液50 mL，每日1次，连续滴入7 d。依据小鼠流涕、喷嚏和抓鼻等症状评分评估其造模状况，造模成功标准为症状评分>5分[8]。将造模成功小鼠随机分为模型组、氯雷他定组、升气壮阳汤组，每组10只。氯雷他定组给予氯雷他定药液20 mg/kg灌胃，升气壮阳汤组将煎煮的10 mL升气壮阳汤放入超声雾化器中进行雾化，每次10 min，模型组与空白组给予同等体积生理盐水灌胃，均每天干预1次，连续干预28 d。

1.5观察指标

1.5.1小鼠鼻部症状评分 分别于造模前及干预第7，14，28天记录各组小鼠鼻部症状(包括鼻涕、喷嚏、鼻痒)评分。鼻涕流至鼻孔计1分，流过鼻前孔计2分，满面流涕计3分；5 min内喷嚏1～3个计1分，4～10个计2分，11个及以上计3分；鼻痒，轻度擦鼻几次计1分，抓挠鼻面不止计2分。

1.5.2血清指标 干预结束后，取各组小鼠腹腔静脉血，3 500 r/min离心15 min，取上清液，酶联免疫法检测血清中IgE、组胺、IL-4、IL-2、IL-5、IL-10、IFN-γ水平。

1.5.3鼻黏膜组织中GATA3、T-bet、Tim1、Tim3 mRNA表达量 采用RT-PCR法检测：取鼻黏膜组织80 mg，研磨并加入Trizol 1 mL混合均匀，提取上层RNA溶解物后测浓度。取总RNA 2 μg进行逆转录，反应条件为37 ℃反转录15 min，85 ℃，5 s，合成cDNA。PCR引物序列：GATA3上游为5’-GTAGTATAGTAGTAGTATA-3’，下游为5’-GATACTACTAGTAGTATGT-3’； T-bet上游为5’-GTATAGTACTAGTAGTAGA-3’，下游为5’-GGTAGTAGCAGTCGTAGTA-3’；Tim1上游为5’-TGGTTGTCACCAGGTACATCATTATA-3’，下游为5’-TGCGTTCTGCAAAGCTCTACTC-3’；Tim3上游为5’-CAATTCCCTGGCCCAATGAATGA-3’，下游为5’-ACTTCCCTCAGTGGTTAGGGTTCT-3’；β-actin上游为5’-GTACTAGTCGTAGCAGTAG-3’，下游为5’-GCTAGTCAGTCAGCTAGCT-3’。PCR扩增反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃，15 s，60 ℃退火延伸45 s采集信号，重复40个循环。每个组别做3次定量检测，采用公式Q=2-ΔΔCt,计算mRNA的相对表达量。

2 结 果

2.1各组小鼠鼻部症状评分比较 造模前各组小鼠鼻部症状评分比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；干预第7，14，28天，模型组小鼠鼻部症状评分均明显高于空白组(P均<0.05)，氯雷他定组和升气壮阳汤组均明显低于模型组(P均<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠鼻部症状评分比较分)

2.2各组小鼠血清IgE、组胺、IL-4、IL-2、IL-5、IL-10、IFN-γ水平比较 与空白组比较，模型组小鼠血清IgE、组胺、IL-4、IL-5、IL-10水平均明显升高(P均<0.05)，血清IL-2、IFN-γ水平均明显降低(P均<0.05)；与模型组比较，氯雷他定组和升气壮阳汤组血清IgE、组胺、IL-4、IL-5、IL-10水平均明显降低(P均<0.05)，血清IL-2、IFN-γ水平均明显升高(P均<0.05)。见表2。

表2 各组小鼠血清IgE、组胺、IL-4、IL-2、IL-5、IL-10、IFN-γ水平比较

2.3各组小鼠鼻黏膜组织中GATA3 、T-bet、Tim1、Tim3 mRNA表达量比较 与空白组比较，模型组小鼠鼻黏膜组织中GATA3、Tim1、Tim3 mRNA表达量均明显升高(P均<0.05)，T-bet mRNA表达量明显降低(P<0.05)；与模型组比较，氯雷他定组和升气壮阳汤组小鼠鼻黏膜组织中GATA3、Tim1、Tim3 mRNA表达量均明显降低(P均<0.05)，T-bet mRNA表达量均明显升高(P均<0.05)。见表3。

表3 各组小鼠鼻黏膜组织中GATA3 、T-bet、Tim1、Tim3 mRNA表达量比较

3 讨 论

变应性鼻炎患者临床表征主要表现为鼻流清涕、鼻痒、鼻塞及喷嚏等，遇寒加重或者发作。许尤佳主任经多年的临床经验，结合研读中医四大经典与儿科鼻祖钱乙的《小儿药证直诀》后，提出“儿为虚寒”理论，认为“升气”旨在提升健脾益气功效；“壮阳”旨在补益肾元,温壮元阳,以制下元之虚寒,扭转其虚寒体质[9]。脾气旺则气血生化盛,元阳壮又可温壮脾阳, 脾肾双补,虚寒尽去,虚寒之体得以扭转。升气壮阳汤组成中补骨脂、续断补肾助阳，白术、太子参健脾益气，升麻可扶助提升阳气，防风可升脾之清阳，陈皮、芒果核、石菖蒲可理气化湿，甘草调和诸药，全方共奏温肾健脾、升阳降浊之功[10]。本研究以许尤佳教授提出的“儿为虚寒”为理论，选取健康幼鼠建立变应性鼻炎模型，观察升气壮阳汤超声雾化法干预对变应性鼻炎的作用，其中中药超声雾化仪可将喷射出的雾化微粒直径控制在1～5 μm，有利于药物吸收，结果显示干预后升气壮阳汤组小鼠鼻部症状评分明显降低，体现了局部给药与整体治疗相结合的特色。

变应性鼻炎是由环境中变应原激发并由IgE介导的鼻黏膜慢性非感染性炎症反应，以辅助T淋巴细胞1(Th1)/辅助T淋巴细胞2(Th2)免疫失衡为特点[11]。正常机体内Th1/Th2的动态平衡主要由分泌细胞因子来维持，当变应性鼻炎发生后，Th1细胞因子表达被抑制，Th2细胞因子表达增多，使得Th1/Th2的动态平衡被打破。IFN-γ、IL-2主要由Th1细胞分泌，IL-4、IL-5主要由Th2细胞分泌[12]。IL-2可促进T细胞活化、增殖，IFN-γ可抑制B细胞合成IgE，此外，也可阻断Th0细胞向Th2型细胞分化。研究显示，Th2细胞优势分化和IL-4、IL-5细胞因子的过度表达可引发或加重变应性鼻炎的发生发展[13-14]。本实验结果显示，模型组小鼠血清中IgE、组胺、IL-4、IL-5、IL-10水平均明显高于空白组，IL-2、IFN-γ水平明显低于空白组，可见变应性鼻炎小鼠出现Th1/Th2失衡，与临床变应性鼻炎患者发病特点相符合；升气壮阳汤组干预后小鼠血清中IgE、组胺、IL-4、IL-5、IL-10水平均明显降低， IL-2、IFN-γ水平均明显升高，提示升气壮阳汤可改善小鼠机体Th1/Th2失衡。

转录因子T-bet是转录因子T-box超家族成员，能够诱导原代T细胞表达T-bet，调控抗炎因子的表达，加速Th1的分化，诱导抗炎因子IFN-γ的产生[15]。GATA-3是调控致炎因子的重要蛋白，可以促进Th细胞向Th2细胞分化，诱导IL-4、IL-5上调。同时，GATA3为当前唯一能够调节所有关键Th2型细胞因子合成的重要蛋白，因此GATA-3与T-bet的表达最终决定了Th0向Th1/Th2分化[16]。本实验结果显示，模型组小鼠鼻黏膜组织中T-bet mRNA表达量明显降低，GATA-3 mRNA表达量明显升高，提示变应性鼻炎小鼠存在明显炎症反应，Th1/Th2失衡；升气壮阳汤组干预后鼻黏膜组织中T-bet mRNA表达量明显上调， GATA-3 mRNA表达量明显下调，提示升气壮阳汤可调节小鼠机体Th1/Th2趋于平衡。

Tim1主要由Th2细胞以及一些初始T细胞表面表达，可刺激T细胞增殖，在调节 Th2细胞的增殖、分化和分泌细胞因子中发挥重要作用[17]。Tim3作为辅助T细胞免疫功能的关键分子，其表达主要聚集于活化的 Th1细胞表面， Tim3与相关配体结合后可抑制Th1型免疫应答，产生负性调节作用[18]。本实验结果显示，模型组小鼠鼻黏膜组织中Tim1、Tim3 mRNA表达量均明显增高，升气壮阳汤组干预后二者表达量均明显降低，提示升气壮阳汤可有效调控Th2、Th1的增殖、分化和免疫应答。

综上所述，升气壮阳汤通过超声雾化法给药可改善变应性鼻炎小鼠的临床症状，相关作用机制可能与降低小鼠血清中炎症因子的表达，调控小鼠机体Th1/Th2动态平衡有关。但本实验研究缺乏病理学指标观察，且基于中药多途径、多靶点的治病理论，需深入研究升气壮阳汤干预变应性鼻炎的相关作用通路，以进一步明确其具体作用机制。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。