清肺化痰颗粒对慢性阻塞性肺疾病急性加重期大鼠相关炎症因子及氧化应激反应的影响研究

王 妍,朱虹江,和春芳,徐 莹,明 溪,李 晓

(云南省中医医院， 云南 昆明 650021)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是呼吸系统的常见疾病之一，其特点为不完全可逆和进行性的气流受限，临床主要表现为咳嗽、咳痰和喘息。目前每年因COPD死亡的人数约600万人，占总死亡人数的6%[1]。慢性阻塞性肺疾病急性加重期(AECOPD)患者病情重，65岁以上AECOPD患者的病死率高达30%[2]。目前西医治疗方案只能部分缓解患者的症状，不能改变COPD的自然病程，因此如何有效治疗该病一直是临床研究的热点问题。清肺化痰颗粒是由第二批全国名师带徒专家、云南省名中医陈乔林教授之经验方“清肺化痰汤”依据中医药理论而制成的合剂。郭昉等[3]研究表明，清肺化痰汤可能通过调节固有免疫中TLR4-MyD88/TRIF-NF-κB信号传导通路及Th17介导的获得性免疫而干预AECOPD患者炎症反应，从而更好地改善患者临床症状。动物实验研究表明，清肺化痰汤能调节COPD大鼠氧化/抗氧化失衡,增强抗氧化能力,从而抑制气道炎症反应,保护肺组织[4]。本课题组通过建立大鼠AECOPD模型，观察了清肺化痰颗粒对AECOPD的干预作用及可能作用机制，旨在为清肺化痰颗粒的临床应用提供更多科学依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 成年SPF级健康雄性Wistar大鼠60只，体重180～220 g，购自昆明医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK(滇)2011-0004。所有动物均适应性喂养1周，饲养室温度20～24 ℃，湿度43%～48%。

1.2药物及试剂 清肺化痰颗粒(院内制剂，由槲寄生30 g、金荞麦30 g、鱼腥草30 g组成)，琥乙红霉素片(赛诺菲杭州制药有限公司，国药准字H33022279，0.125 g/片)，内毒素(美国Sigma-Aldrich公司)，金黄色葡萄球菌(昆明医科大学医学病原学与免疫实验室)，戊巴比妥钠(北京普博斯生物科技有限公司)，紫云烟(云南红云集团，焦油量14 mg、烟气烟碱量1.2 mg、烟气化碳量15 mg)，白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)试剂盒(深圳晶美生物技术有限公司)，基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、组织金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3仪器 台式高速离心机(深圳市赛泰克生物科技有限公司)，-80 ℃超低温冰箱(德国Eppendorf 公司)，石蜡切片机(德国SLEE公司)，倒置光学显微镜(日本Nikon公司)，Multiskan Mk3型酶标仪(美国Thermo公司)。自制动物熏吸箱(规格：60 cm×50 cm×40 cm)。

1.4实验方法 将60只大鼠随机分为正常组、模型组、琥乙红霉素组及清肺化痰颗粒高、中、低剂量组，每组10只。除正常组外，其余各组大鼠参照文献[5]方法，采用被动吸烟加气管内注入内毒素的方法复制COPD大鼠模型。在实验的第7，14，28天，腹腔注射l%的戊巴比妥钠溶液40 mg/kg麻醉大鼠，之后取仰卧位固定并暴露声门，用1 mL注射器向气管内注入1 mg/mL的内毒素0.2 mL，然后将大鼠置入自制的熏吸箱内(注入浓度为5%的香烟烟雾)30 min。在实验的第29天经鼻腔滴入金黄色葡萄球菌0.3 mL，2次/d，连续3 d，制备AECOPD大鼠模型。造模成功后，琥乙红霉素组给予3.15 g/kg琥乙红霉素溶液灌胃，清肺化痰颗粒高、中、低剂量组给予清肺化痰颗粒溶液9.94 g/kg、4.97 g/kg、2.49 g/kg灌胃，正常组、模型组给予生理盐水灌胃，灌胃体积均为1 mL/100g，1次/d，连续14 d。给药剂量根据《中药药理研究方法学》[6]中人与大鼠按体表面积转换系数换算。

1.5样本采集方法 末次灌胃后24 h，以3%戊巴比妥钠溶液麻醉大鼠，腹主动脉取血，常温静置2 h，3 000 r/min离心5 min，分离血清，置于-80 ℃ 冰箱待测。取血完毕后，迅速取出左肺叶组织，一部分肺组织匀浆后，3 000 r/min离心5 min，分离上清液，-80 ℃冰箱冻存待测。另一部分置入4%多聚甲醛溶液中固定备用。

1.6观察指标

1.6.1大鼠症状行为学表现 实验过程中对各组大鼠进行症状行为学观察，包括咳嗽、精神状态、活动、食欲、黏膜颜色，皮毛颜色、体重变化等。

1.6.2病理形态学观察 取4%多聚甲醛溶液固定好的左肺叶组织，常规脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切成5 μm厚的切片，备做HE染色。光镜下观察肺组织炎症反应、气管和肺泡改变、血管平滑肌增殖等病理学情况。

1.6.3血清和肺组织中相关指标水平 采用ELLSA 法检测血清和肺组织上清液中IL-6、TNF-α、MMP-9、TIMP-1水平，采用化学比色法检测血清和肺组织上清液中SOD、MDA水平，严格按照试剂盒说明进行操作。

2 结 果

2.1各组大鼠症状行为学变化 各造模组大鼠于造模第7天出现咳嗽，第15天咳嗽加重，食量和活动减少，精神状态变差，睡眠变多，口唇出现发绀。第20天体重开始减轻，鼠尾变为灰暗色。清肺化痰颗粒高、中剂量组大鼠用药5 d，咳嗽减轻，食量和活动增加，用药9 d后精神状态好转，睡眠减少。琥乙红霉素组和清肺化痰颗粒低剂量组于用药8 d后咳嗽缓解，食量好转，12 d后精神状态好转，活动量增加，毛色变白。

2.2各组大鼠肺组织病理学变化 正常组大鼠肺组织仅有少量炎性细胞，气管壁完整，肺泡正常，见图1；模型组大鼠气管和肺泡中可见大量炎性细胞浸润，纤毛柱状细胞部分剥脱，黏膜充血，杯状细胞增生，血管壁和支气管平滑肌增厚，肺泡破坏，融合为肺大泡，见图2；琥乙红霉素组和清肺化痰颗粒低剂量组大鼠肺组织中炎性细胞浸润和黏膜充血略有改善，肺泡破坏和融合较少，见图3及图4；清肺化痰颗粒高、中剂量组大鼠肺组织中炎性细胞明显减少，黏膜充血和管壁增厚情况明显改善，肺泡破坏和融合少，见图5及图6。正常组、模型组、琥乙红霉素组及清肺化痰颗粒高、中、低剂量组肺组织病理半定量评分分别为(1.04±0.09)分、(2.02±0.53)分、(1.56±0.17)分、(1.25±0.11)分、(1.27±0.12)分、(1.58±0.19)分，模型组显著高于正常组 (P<0.05)，琥乙红霉素组和清肺化痰颗粒各组均显著低于模型组(P均<0.05)，且清肺化痰颗粒高、中剂量组显著低于琥乙红霉素组(P均<0.05)。

图1 正常组大鼠肺脏组织HE染色表现(×100)

图2 模型组大鼠肺脏组织HE染色表现(×100)

图3 琥乙红霉素组大鼠肺脏组织HE染色表现(×100)

图4 清肺化痰颗粒低剂量组大鼠肺脏组织HE染色表现(×100)

图5 清肺化痰颗粒高剂量组大鼠肺脏组织HE染色表现(×100)

图6 清肺化痰颗粒中剂量组大鼠肺脏组织HE染色表现(×100)

2.3各组大鼠血清和肺组织中IL-6、TNF-α及IFN-γ水平比较 模型组大鼠血清和肺组织中IL-6、TNF-α、IFN-γ水平均显著高于正常组(P均<0.05)；琥乙红霉素组及清肺化痰颗粒各剂量组大鼠血清和肺组织中IL-6、TNF-α、IFN-γ水平均显著低于模型组(P均<0.05)，且清肺化痰颗粒高、中剂量组均显著低于琥乙红霉素组(P均<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清和肺组织中IL-6、TNF-α及IFN-γ水平比较

2.4各组大鼠血清和肺组织中MMP-9、TIMP-1水平及MMP-9/TIMP-1比较 模型组大鼠血清和肺组织中MMP-9、TIMP-1水平及MMP-9/TIMP-1均显著高于正常组(P均<0.05)；琥乙红霉素组及清肺化痰颗粒各剂量组大鼠血清和肺组织中MMP-9、TIMP-1水平及MMP-9/TIMP-1均显著低于模型组(P均<0.05)，且清肺化痰颗粒高、中剂量组均显著低于琥乙红霉素组(P均<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清和肺组织中MMP-9、TIMP-1水平及MMP-9/TIMP-1比较

2.5各组大鼠血清和肺组织中MDA、SOD水平比较 与正常组比较，模型组大鼠血清和肺组织中MDA水平显著增高(P<0.05)，SOD水平显著降低(P<0.05)；与模型组比较，琥乙红霉素组及清肺化痰颗粒各剂量组大鼠血清和肺组织中MDA水平显著降低(P均<0.05)，SOD水平显著增高(P均<0.05)；与琥乙红霉素组比较，清肺化痰颗粒高、中剂量组MDA水平更低(P均<0.05)，SOD水平更高(P均<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血清和肺组织中MDA、SOD水平比较

3 讨 论

COPD的发病与环境因素关系较为密切，吸烟、粉尘和空气污染都可以刺激支气管黏膜，引起支气管痉挛，降低气道黏膜的抵抗力和气管黏膜纤毛的活动度，损伤清除功能，且呼吸道感染在COPD的发生和发展过程中扮演着重要角色[7-8]。COPD的病理特征为气道重塑、弹性消失，肺泡破坏，从而引起气流受限和过度充气，气流受限主要发生于直径在2 mm以下的气道[9]。COPD急性加重的主要原因是细菌或病毒感染，其病理表现主要为通气-血流比例失调，引起气体交换障碍，导致低氧血症[10]。

气道的慢性炎症反应是COPD的主要发病机制之一，并且在急性加重期尤为明显。研究表明，COPD患者的慢性炎症反应波及气道、肺泡和肺实质，涉及IL-6、 IL-8、 IL-13、TNF-α、IFN-γ、GM-CSF等50多种炎症和细胞因子[11]。IL-6可以促进B细胞增殖和分化，引起中性粒细胞的趋化和激活，参与炎症的发生和发展，损伤肺组织[12]。TNF-α主要由单核巨噬细胞产生，在炎症反应和免疫应答中起着重要作用，是机体炎症反应的敏感指标，其可以加强中性粒细胞的炎性作用，促进中性粒细胞向肺组织趋化、黏附和渗出，释放弹性蛋白酶，增强氧化反应，从而损伤上皮细胞，导致肺气肿[13]。IFN-γ主要由T细胞和NK细胞产生，并增强其活力，参与免疫调节反应，增加免疫细胞的杀伤活性[14]。

COPD的发病机制还包括蛋白酶/抗蛋白酶的失衡，中性粒细胞和巨噬细胞都可以释放多种蛋白酶对肺组织产生损伤。MMP-9是一种巨噬细胞来源的基质金属蛋白酶，参与气道重构和炎症细胞浸润，可以降解气道和肺的细胞外基质，降低肺泡弹性，使肺泡腔扩大，导致肺气肿的形成[15]。TIMP-1等蛋白酶抑制物的作用正好相反，其由成纤维细胞等产生，可以抑制MMP-9的活性，减少细胞外基质的降解，促进修复重塑。COPD发病过程中MMP-9和TIMP-1含量之比增高，说明炎性反应占优势，细胞外基质的降解加快，反之则说明细胞外基质以修复为主[16]。

氧化/抗氧化失衡在COPD的发生和发展过程中也发挥着重要作用[17]。MDA是一种过氧化产物，与氧自由基含量呈正相关，可以反映组织损伤的严重程度。SOD是一种具有细胞保护作用的金属酶，可以使过氧化物分解为过氧化氢和氧，从而有效清除机体内的氧自由基，对抗过氧化阴离子自由基，保护生物膜。COPD患者肺组织中由于炎症细胞浸润，产生大量的活性氧，氧化/抗氧化动态平衡被打破，损伤肺泡上皮细胞功能，导致渗出增加，气流受限[18]。

COPD属中医学中“喘证”“肺胀”等范畴，痰热壅肺证较为多见，其病位在肺，病机为肺本虚而气不足，外邪犯肺引起肺失宣肃、痰邪郁阻，日久蕴热，最终导致脾肺肾虚。因此治疗上应采取扶正补虚、清肺化痰之策略[19]。清肺化痰颗粒的成分为槲寄生、野荞麦和鱼腥草，方中槲寄生为君药，味辛苦温，《陆川本草》言其功效为 “镇咳，祛风湿”，《广西药植名录》载其“治虚损劳伤咳嗽”等，肯定了该药的止咳、祛痰作用。金荞麦为臣药，味酸苦寒，有清热解毒、活血疗疮之功效，《纲目拾遗》云其能“治喉闭，喉风，喉毒”。鱼腥草为佐药，味辛、微寒，《本草经疏》载其“治痰热壅肺”。三药合用共奏清热解毒、宣肺消痈之功。现代药理学研究表明槲寄生中的黄酮类化合物具有减轻炎症反应，清除自由基和抗氧化的功能[20]。金荞麦中的原花青素缩合性单宁混合物可以减轻呼吸道的炎症反应，减少TNF-α表达，保护大鼠肺组织，其中的表儿茶素可以有效清除超氧阴离子自由基，具有抗氧化作用[21]。鱼腥草中的挥发油和黄酮类物质等有效成分可以调节多种细胞因子的mRNA表达，对抗炎症反应和氧化反应，同时其对多种细菌和病毒有较强的杀伤能力[22]。

本实验结果显示，模型组大鼠肺组织病理半定量评分提高，血清和肺组织中IL-6、TNF-α、IFN-γ、MMP-9、TIMP-1、MDA水平及MMP-9/TIMP-1均显著升高，SOD水平显著降低，说明模型建立成功，模型大鼠体内存在炎症反应及氧化应激反应；琥乙红霉素组及清肺化痰颗粒干预后，各组大鼠肺组织病理半定量评分和血清及肺组织中IL-6、TNF-α、IFN-γ、MMP-9、TIMP-1、MDA水平及MMP-9/TIMP-1均显著降低，SOD水平显著增高，尤其以肺化痰颗粒高、中剂量组作用显著。提示清肺化痰颗粒可有效改善AECOPD大鼠的症状，减轻病理损伤，且其作用强度呈剂量依赖性，其作用机制可能与降低炎症因子IL-6、TNF-α、IFN-γ水平，调节蛋白酶/抗蛋白酶失衡和氧化应激失衡有关。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。