重组巨细胞病毒多肽检测特异性IgG抗体及抗体亲合力指数的评价

陈洁，江源，冯静，周乙华，胡娅莉，戴毅敏

南京大学医学院附属鼓楼医院，南京210008

巨细胞病毒（CMV）宫内感染是引起胎儿畸形的重要病原体［1］，CMV 宫内感染对胎儿的影响程度与母体孕期CMV感染类型有关［2-3］，CMV IgG亲合力指数（AI）检测是目前公认能够有效区分CMV 感染类型的方法［4］。CMV 有超过200 个开放阅读框，编码的多种蛋白可设计作为重组抗原检测特异性IgG抗体。既往研究报道显示，CMV 的被膜磷蛋白150（pp150）、pp28、包膜糖蛋白gB（gB）及非结构蛋白pp52 等能被大部分CMV IgG 阳性血清识别，因而可能替代全病毒抗原用于检测CMV IgG 抗体［5-6］。本研究中，我们选取与进口试剂盒检测IgG 一致性较好的重组多肽进一步用于检测CMV IgG AI，即在重组多肽ELISA 基础上引入尿素变性处理［7］，使低亲合力抗体与抗原的结合明显减少，而几乎不影响高亲合力抗体与抗原的结合，从而判断重组多肽是否同时适合用于CMV IgG AI 检测以正确区分患者CMV感染类型。

1 材料与方法

1.1 研究对象 2006-2009年采集并保存南京大学医学院附属鼓楼医院41例新生儿出生后1、3.5、8个月和2岁时的外周血，以进口试剂检测血清CMV IgG，随访至2岁，9例未见感染CMV，32例在2岁前首次感染CMV。2011年6月—9月随机采集南京市0～8岁儿童200 例血清，其中CMV IgG 阴性74 例、CMV IgG 阳性126例，用于初步评估重组多肽的抗原性。另外，从上述随访期间明确首次感染的32例婴幼儿中随机挑选8例原发感染血清以及7例确定为潜在感染血清，以初步判断重组多肽是否同时适合IgG AI检测。

1.2 重组多肽抗原的制备 根据文献报道选取在人群中高度保守且编码蛋白能被大部分CMV IgG阳性血清识别的基因片段及相应的引物序列，以CMV感染患者的外周血白细胞DNA 为模板，采用巢式PCR 扩增目的基因片段。参考本实验室既往方法［8］，应用分子克隆技术将扩增的各基因片段克隆入表达载体pRSET-A（美国Invitrogen 公司）合成重组蛋白多肽。用Ni-NTA琼脂糖凝胶层析方法（德国Qiagen 公司）纯化重组蛋白，从而分别获得高纯度8种重组多肽，即pp150/1、pp150/2、pp150/3、pp150/4、pp52/1、pp52/2、pp28、gB。

1.3 重组多肽检测血清CMV IgG 随机挑选经CMV IgG ELISA 进口 试剂盒检测126 例CMV IgG 阳性和74例CMV IgG阴性标本［11］，采用ELISA法以重组多肽检测血清CMV IgG表达。将纯化的8种重组多肽分别稀释于碳酸盐包被缓冲液，终浓度为1 μg/mL，100 μL/孔，包被96 孔板，4 °C 过夜。次日甩净、拍干，PBST 洗涤3 次，每孔加300 μL 封闭液（5%脱脂奶-PBST），37 °C 封闭1 h；甩净、拍干后，每孔加入100 μL 用封闭液1∶100 稀释的待测血清样本、阴性对照和阳性对照，空白孔空置；37°C 温育1 h；PBST洗涤5 次，甩干、拍净后每孔加100 μL 用1×PBST 1：4000 稀释的HRP 标记的羊抗人IgG 抗体，空白孔除外；37°C 温育1 h；PBST 洗涤5 次后拍干，加入四甲基联苯胺；室温避光孵育15 min 后，每孔加100 μL 0.3 mol/L H2SO4终止反应；用酶标仪读取450 nm 吸光度OD 值。结果判断：待测血清样本OD 值＞阴性对照+2s时，判断为阳性，否则为阴性。

1.4 重组多肽检测血清CMV IgG AI 在重组多肽ELISA 法基础上引入8 mol/L 尿素变性；抗原包被同重组多肽ELISA 法，用5%脱脂奶-PBST 稀释待测血清，至CMV IgG 浓度在8 IU/mL 左右［9］。微孔板上对应两孔，分别加入50 μL 稀释后待测血清；然后其中一孔设为参照孔，再加入50 μL 1×PBST；另一孔为变性孔，再加入50 μL 8 mol/L 尿素（1×PBST 稀释）。其余步骤同重组多肽ELISA 法。结果判定：AI=（变性孔OD值/参照孔OD值）×100%。

1.5 进口试剂检测CMV IgG 抗体及IgG AI 采用固相酶联免疫法试剂（意大利DIA.PRO公司）检测血清中CMV IgG抗体。血清标本用稀释液1∶100稀释，检测步骤按照说明书进行，每次均设立标准品对照。CMV IgG AI检测采用与CMV IgG检测相同的试剂盒进行，采用本研究室建立的方法检测抗体亲合力［7］。

1.6 统计学方法 采用SPSS 17.0 软件对数据进行统计学分析。率的比较采用R×C列表卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重组多肽抗原成功制备的验证 利用重组多肽在氨基端的His6标识，用抗His6单克隆抗体检测，免疫印迹法显示在对应预期分子质量大小位置附近均可见棕色条带，提示抗His6单克隆抗体能与各重组多肽表达的蛋白发生特异性结合，说明基因表达阅读框正确。见图1。

图1 8种重组多肽的条带表达

2.2 重组抗原检测血清CMV IgG 表达情况 将CMV IgG ELISA 进口试剂盒检测的126 例CMV IgG阳性和74 例CMV IgG 阴性标本，与8 种重组抗原检测血清CMV IgG 表达情况进行比较，显示126 例CMV IgG阳性标本，pp150/4检测血清特异性抗体阳性符合率为90.9%（100/110，存在检测血清样本量不足情况），重组抗原pp150/2 和pp150/3 检测阳性符合率亦分别为89.7%（113/126）和88.9%（112/126）；74 例CMV IgG 阴性标本，重组抗原gB 检测阴性符合率为98.6%（73/74），重组抗原pp150/2、pp150/3 和pp150/4 的阴性符合率分别为94.6%（70/74）、95.9%（71/74）和97.0%（64/66，存在检测血清样本量不足情况）。与进口ELISA试剂盒比较，重组多肽pp150 检测CMV IgG 抗体的阳性率差异无统计学意义（P均＞0.05）。见表1。

2.3 重组抗原检测血清CMV IgG AI 情况 根据重组抗原ELISA 检测CMV IgG 的结果，我们选取阳性和阴性符合率均相对较高的重组抗原pp150/2、pp150/3 和pp150/4，进一步检测8 例明确原发感染的婴幼儿血清、7 例确定为潜在感染的儿童血清的CMV IgG AI。8 例经进口试剂确定为原发感染血清的AI 值为15.3%～29.8%；以重组抗原pp150/4 检测时，4 例AI 值＜30%，4 例AI 值＞30%（39.0%～60.4%），与进口试剂检测值比较差异有统计学意义（P均＜0.05）。7例明确为潜在感染的血清进口试剂AI 值为59.6%～92.3%，2 例经重组抗原检测AI 值分别为22.9%和25.1%，与进口试剂检测结果比较差异有统计学意义（P均＜0.05）。同样，利用重组抗原pp150/2和pp150/3检测的IgG AI值与进口试剂盒检测值比较差异有统计学意义（P均＜0.05）。见表2。

表1 重组抗原检测血清CMV IgG表达与进口试剂盒比较（例）

表2 重组抗原检测血清CMV IgG AI与进口试剂结果比较（%）

3 讨论

ELISA 检测血清特异性抗体具有灵敏、特异、快速、方便的特点，故在临床诊断中广泛应用。国内外研究报道多种CMV 重组多肽表达的蛋白可用于CMV 抗体检测，主要包括蛋白pp150、pp52、pp28 及gB 等［9-11］，其灵敏度及特异性各有差异。本研究利用分子克隆技术构建了8 种含有CMV 多肽基因序列的表达质粒，并获得了纯化的蛋白多肽，进一步以此为基础建立了间接ELISA 检测CMV IgG 抗体。在比较重组多肽ELISA 与进口ELISA 试剂盒的检测一致性时发现，8 种重组抗原均显示了较高的阴性符合率，尤其是gB 多肽。但同时也可以发现部分经进口ELISA试剂盒检测为阴性血清样本在重组多肽检测时判断为阳性，推测可能为重组抗原的非特异性吸附导致的假阳性。此外，我们发现重组多肽pp150 检测血清IgG 抗体的阳性符合率明显优于其他重组多肽pp52、pp28 和gB，与既往文献报道相一致［12］。进一步比较pp150的4个截短多肽，可以发现羧基端的重组多肽（pp150/2、pp150/3、pp150/4）的阳性符合率相近，且高于氨基端的重组多肽pp150/1，提示pp150蛋白的主要抗原表位位于其羧基端。另外，虽然pp150羧基端的重组多肽检测特异性抗体时阳性符合率较高，但并未能检出所有阳性血清。有研究发现［13］，多个抗原性多肽片段融合后的血清反应阳性率通常高于单一多肽抗原。因此，构建多个基因片段的表达质粒以获取重组融合蛋白，如pp150多肽片段或与pp52、pp28等其他重组多肽，或尝试将几种单独表达的重组抗原混合后作为包被抗原，以评估是否能提高CMV特异性抗体的阳性检出率。

CMV IgG AI 检测有助于正确判断孕妇CMV 感染类型。目前国外已有CMV IgG AI 检测试剂盒上市，质量较好，诊断价值可靠，但价格较为昂贵。而目前国内虽然有CMV IgG ELISA 检测试剂盒，但并无适合于AI检测的相关试剂盒。本研究中，我们选取与试剂盒检测IgG 一致性较好的重组多肽进一步检测AI，即在重组多肽ELISA 基础上引入尿素变性处理，以探讨重组抗原是否同时适合于AI检测。由于CMV IgG 抗体浓度对AI 的检测存在影响［14］，我们预先适当比例稀释血清标本以调整IgG 浓度在合适的范围［15］。尽管利用重组多肽仅检测了小部分确定为原发感染或潜在感染的血清，然而初步实验结果显示，根据重组多肽检测AI值判断的感染状态与实际感染状态的一致性较差，尤其是检测原发感染血清时。因此，尽管本研究构建的CMV 重组多肽虽然在检测特异性IgG 抗体时具有较好的反应性，但并不适合于AI检测，推测可能是由于通过大肠杆菌原核表达的重组蛋白与全病毒培养获得的抗原构象不同所致。因此，仍需进一步实验如表达其他重组多肽抗原或者通过全病毒培养、纯化获取相关抗原，以建立同时适合于CMV IgG AI检测的ELISA试剂。